造血细胞及其检验专家讲座

第一篇造血细胞及其检验

造血细胞及其检验第1页造血（hematopoiesis）是指血细胞生成过程。造血干细胞在造血微环境中增殖、分化为各类血细胞。造血系统经过造血器官、造血干细胞、造血调控因子等组成复杂网络来维持血液细胞动态平衡。造血细胞及其检验第2页第一节造血器官和造血微环境

一、造血器官人体造血器官是生成血液器官起源于中胚叶，主要包含骨髓、胸腺、淋巴结、肝脏和脾等其造血过程分为胚胎期造血和出生后造血造血细胞及其检验第3页（一）胚胎期造血器官

人类血液细胞首先在卵黄囊中形成，肝、脾、胸腺和骨髓均参加造血依据发育过程中造血中心转移，胚胎期造血又分为三个时期：

卵黄囊造血期

、肝造血期

、骨髓造血期造血细胞及其检验第4页1．卵黄囊造血期（中胚叶造血期）始于胚胎3周左右，卵黄囊壁上中胚层细胞开始分化聚集成团，称为血岛（bloodisland）。血岛是人类最初造血中心。血岛外周细胞逐步变长，分化为血管内皮细胞造血细胞及其检验第5页血岛中央细胞形成多能造血干细胞，继尔分化成幼稚红细胞，以后大量多能造血干细胞迁移至肝、脾、骨髓和淋巴组织继续增殖、分化为干细胞。胚胎

2个月后，卵黄囊逐步退化、萎缩,被肝、脾取代其造血功效。

造血细胞及其检验第6页2．肝造血期

始于胚胎第6周，是卵黄囊血岛造血干细胞移植到肝脏结果，以造红细胞为主，后期可生成粒细胞和巨核细胞。肝脏是胚胎2~5个月造血中心，连续至第7个月时，逐步被骨髓造血替换。另外脾、胸腺、淋巴结等也参加造血。造血细胞及其检验第7页

胎肝造血规律：造血细胞分布在肝窦、肝细胞索之间。胎肝造血以幼稚红细胞为主，巨核细胞常与红系细胞在一起。胎肝造血细胞密度随妊娠日期不一样而改变。证实肝造血在第15周以前为上升期，15~30周为旺盛期，24周以后为减退时期，至出生前停顿。故肝造血为第二代造血。造血细胞及其检验第8页脾造血

始于胚胎第3个月，主要生成红细胞、粒细胞，第5个月时产生淋巴细胞、单核细胞，而红细胞和粒细胞产生逐步降低。至出生时，脾已成为产生淋巴细胞器官。胸腺

在胚胎期主要产生淋巴细胞和少许红细胞、粒细胞，胚胎后期成为诱导和分化T淋巴细胞器官。淋巴结

在胚胎早期可产生红细胞，但时间很短，在胚胎4个月以后，成为终生制造淋巴细胞和浆细胞器官。

造血细胞及其检验第9页3．骨髓造血期自胚胎第14周骨髓开始造血，5个月以后成为胚胎期造血中心。骨髓中造血干细胞起源于肝、脾种植，可维持终生。胚胎期骨髓主要生成红细胞、粒细胞和巨核细胞，也生成淋巴细胞和单核细胞。

造血细胞及其检验第10页胚胎期造血三个时期是不能截然分开，而是此消彼长，互为交织。造血细胞及其检验第11页（二）出生后造血出生后造血主要靠骨髓。在正常情况下骨髓是唯一能产生红细胞、粒细胞和血小板场所，也生成淋巴细胞和单核细胞。脾和淋巴结为终生制造淋巴细胞器官。造血细胞及其检验第12页1．骨髓

骨髓是位于骨髓腔内海绵样胶状组织，有红骨髓和黄骨髓之分。婴幼儿骨髓几乎都参加造血，即全为红骨髓。大约从5岁开始，长骨髓腔内出现脂肪细胞，随年纪增加，长骨远端红骨髓逐步被脂肪组织代替转化为黄骨髓。造血细胞及其检验第13页到18岁以后，红骨髓只限于颅骨、脊椎骨、肋骨、胸骨、骼骨以及长骨近心端。所以，在作骨髓穿刺或活检时，成人可选择部位是骼骨、棘突、胸骨等处，胫骨粗隆则只适合用于2岁以下幼儿。成人红骨髓和黄骨髓约各占50%，但黄骨髓仍有造血潜能，当机体需要时又转变为红骨髓而参加造血。造血细胞及其检验第14页2.淋巴器官

分为中枢淋巴器官和周围淋巴器官。中枢淋巴器官主要包含胸腺和骨髓，主导淋巴细胞产生、增殖、分化和成熟。周围淋巴器官主要包含淋巴结、脾、肠粘膜相关淋巴组织等，是淋巴细胞聚集和免疫应答发生场所。

造血细胞及其检验第15页(1)胸腺（thymus）来自骨髓淋巴干细胞经增殖和在胸腺素作用下，诱导分化为免疫活性细胞，进人胸腺髓质，然后释放人血并迁移到外周淋巴器官胸腺依赖区成为胸腺依赖淋巴细胞即T细胞。青春期后，胸腺逐步退化，被脂肪组织取代。

造血细胞及其检验第16页(2)淋巴结（lymphnode）淋巴结外周部分为皮质，B细胞在淋巴结皮质区滤泡中央增殖、发育；皮质深层和滤泡间隙为副皮质区，富含由胸腺迁移而来T细胞，又称胸腺依赖区；淋巴结中央部分为髓质，髓质区B细胞、浆细胞及巨噬细胞集结组成髓索造血细胞及其检验第17页(3)脾脾切面大部分呈暗红色，称红髓，其中散布着许多灰白色小结节，为白髓。白髓是淋巴细胞聚集处，在中央小动脉周围主要是T细胞，是脾胸腺依区；白髓中脾小结位于脾动脉周围淋巴鞘内一侧，内有生发中心，主要由B细胞组成。脾含有造血、储血及免疫等各种功效，是T、B细胞分化成熟主要场所之一。造血细胞及其检验第18页3.髓外造血正常情况下，胎儿出生2个月以后，骨髓以外组织如肝、脾淋巴结等不再制造红细胞、粒细胞和血小板。但在一些病理情况下，如骨髓纤维化、骨髓增生性疾病及一些贫血，这些组织又恢复造血功效（常可造成对应器官肿大），称为髓外造血。造血细胞及其检验第19页髓外造血是机体对血细胞需求尤其增高或对骨髓造血障碍一个赔偿，尤其常见于儿童。这种代偿作用有限且不完善。髓外造血部位除肝、脾、淋巴结外，也能够累及胸腺、肾、肾上腺、腹腔后脂肪及胃肠道。造血细胞及其检验第20页二、造血微环境造血微环境（hematopoieticmicroenvironment）是指造血细胞生长、发育内环境。由微血管系统、末梢神经、基质、基质细胞及基质细胞分泌细胞因子等组成，不但是造血细胞支架，还可经过细胞之间相互作用和释放细胞因子影响造血活动。造血细胞及其检验第21页（一）骨髓微血管系统骨髓微血管系统是造血微环境主要组成部分,其功效在于向造血组织输送营养物质，排出代谢废物，从而有利于造血细胞更新。毛细血管注人管腔膨大静脉窦，再彼此沟通聚集成集合窦，最终进人中央静脉。静脉窦与集合窦（统称为骨髓血窦）是骨髓血管系统关键结构。造血细胞及其检验第22页血窦（Sinusoid）是动脉毛细血管分成不规则窦状腔隙。血窦内是成熟血细胞，血窦之间则充以骨髓实质(造血索)，主要是活跃造血实质细胞。血窦壁是由连续内皮细胞、颗粒状基底膜和外皮细胞所组成，其窦壁薄厚是可变,绝大多数窦壁仅有一层内皮细胞组成，平时无孔，当血细胞穿过内皮细胞时形成暂时通道。造血细胞及其检验第23页不一样造血功效骨髓其微血管结构不一样造血功效旺盛时，骨髓血窦很丰富，窦壁孔隙增多；造血功效低下骨髓，骨髓血窦降低，无造血功效黄骨髓中，微血管呈毛细管状。骨髓微血管系统经过调整物质与能量交换、血细胞释放、组织内酸碱度、氧和二氧化碳分压等影响造血细胞增殖和分化。造血细胞及其检验第24页（二）骨髓神经骨髓神经起源于脊神经，其神经供给十分广泛，骨髓全部动脉都伴有神经束，其分支缠绕于动脉壁呈网状，神经纤维终止于动脉壁平滑肌纤维。骨髓小动脉上交感神经纤维受延髓血管运动中枢控制，但绝大多数骨髓微血管床主要受血管活性物质调整。造血细胞及其检验第25页骨髓神经作用：（1）经过调整血管舒缩，改变血窦大小及血流速度快慢等影响造血（2）神经分泌体液因子可直接作用于造血细胞（3）基质细胞分泌细胞因子调整造血功效造血细胞及其检验第26页（三）基质细胞及其分泌调控因子骨髓基质细胞包含成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞和巨噬细胞等，它们经过与造血干细胞亲密接触起到支持和营养造血细胞作用。各种基质细胞都有分泌细胞因子功效，其分泌生物大分子物质都与造血细胞粘附相关，可粘附固定造血细胞。造血细胞及其检验第27页基质细胞还分泌各种细胞因子，如白细胞介素、FLT-3配基、干细胞因子、粒一巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子等，这些细胞因子不但直接作用于造血细胞，而且作用于基质细胞，改变基质细胞增殖和分泌情况，诱导其它细胞因子生成。对造血细胞增殖、分化和发育成熟起主要调控作用。造血细胞及其检验第28页Goon....造血细胞及其检验第29页第二节

造血细胞生长发育和造血调控一、造血细胞生长发育胚胎造血组织发育是血细胞发生、发育研究基础，也是血液学研究必不可少前提。造血细胞生长发育是一个连续不停复杂过程，造血器官内各种造血细胞在造血微环境中经过细胞与细胞之间相互作用，在各种细胞因子诱导下，按一定规律发育成为各种成熟血细胞，然后释放入血循环中。造血细胞及其检验第30页

（一）造血细胞生长发育概念造血细胞生长发育包含增殖、分化、成熟和释放四个方面。造血细胞增殖是指血细胞经过分裂而使其数量增加过程。有丝分裂是造血细胞主要增殖方式。造血细胞及其检验第31页母细胞有丝分裂后形成子细胞同时都倾向分化成熟。子细胞还可深入增殖，每增殖一次就越倾向于深入分化。普通来讲，一个原始细胞到成熟细胞可经过4~5次分裂，如1个原始红细胞可产生32个或64个成熟红细胞。而巨核细胞增殖（连续双倍增殖DNA）与其它系统血细胞增殖方式不一样，每增殖一次，核增大一倍，但胞质并不分裂，属多倍体细胞，形态上也表现为从原始到成熟胞体逐步变大。造血细胞及其检验第32页造血细胞分化（differentiation）是指细胞发育过程中失去一些潜能又取得新功效过程，即由多潜能转变为单潜能过程。分裂后细胞在形态和功效上产生了新特征，分化过程是不可逆。造血细胞及其检验第33页造血细胞成熟（maturation）是细胞从造血干细胞定向分化后，从原始经幼稚到成熟细胞发育过程，血细胞越成熟其形态越易识别，功效也日趋完善。造血细胞及其检验第34页成熟血细胞在骨髓内经过“髓血屏障”释放入血循环中，各种调整原因控制着血细胞增殖、分化、成熟和释放，从而维持血细胞数量和质量稳定。造血细胞及其检验第35页（二）造血细胞生长发育过程依据造血细胞功效和形态特征，造血细胞生长发育过程可为：造血干细胞、造血祖细胞、原始及幼稚细胞三个阶段。原始及幼稚细胞阶段细胞是在骨髓涂片中从形态学上能够识别各系各阶段血细胞。造血细胞及其检验第36页造血干细胞阶段造血组细胞阶段原始及幼稚细胞阶段成熟细胞造血细胞及其检验第37页二、造血干／祖细胞干细胞（stemcell）是含有自我复制和多向分化能力细胞。早期胚胎中原始生殖细胞即胚胎干细胞，含有广泛发育和分化潜能，称为全能干细胞（totipotenthematopoieticstemcell,THSC）。胚胎干细胞可分化为各类组织干细胞，造血组织中存在造血干细胞、血管干细胞和间质干细胞。造血细胞及其检验第38页（一）造血干细胞造血干细胞（hematopoieticstemcell,HSC）概念于20世纪初就有些人提出，但当初含义不甚明确，研究内容含糊不清，直至发觉了脾集落形成单位之后，造血干细胞在六七十年代引发了人们关注。伴随新技术发展，造血干细胞在临床应用等方面潜在巨大价值被逐步发觉，当前已成为生命科学研究领域热门课题。造血细胞及其检验第39页造血干细胞又称多能干细胞，由中胚层细胞分化而来，是各种血细胞始祖，含有高度自我更新、多向分化和增殖能力，而且在造血组织中含量极少，其形态酷似小淋巴样细胞而难以识别。在体内造血干细胞多数处于Go期。造血干细胞可增殖分化为髓系干细胞和淋巴干细胞。造血细胞及其检验第40页1.造血干细胞基本特征(1)自我更新：即细胞经过有丝分裂产生两个子代细胞与亲代细胞含有相同特征。造血干细胞自我更新是维持其数量平衡基础，亦称自我维持。高度自我更新能力是造血干细胞基本生物学特征之一。造血细胞及其检验第41页(2）多向分化：即造血干细胞具备分化为各系造血祖细胞潜能，是造血干细胞另一个基本生物学特征，造血干细胞分化受到各种正负调控因子调整，在特定条件下能够分化成红细胞、粒细胞（中性、嗜酸性、嗜碱性）、单核细胞、血小板、组织嗜碱细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞及自然杀伤细胞等祖细胞。分化是不可逆，造血干细胞一旦定向分化为某种祖细胞，就不可能再变成其它祖细胞。造血细胞及其检验第42页2．造血干细胞检测

单个细胞在生物体内有能力长久重建造血是判断该细胞为造血干细胞“金标准”。因为造血干细胞数量极少，且形态上不能区分，也没有造血干细胞表面标志，当前还没有建立体外直接测定造血干细胞方法。造血细胞及其检验第43页（1）脾集落测试法

1961年Till等首先采取体内试验小鼠脾集落形成间接证实了造血干细胞存在：将受体小鼠以致死剂量射线照射后，破坏全部造血细胞，动物因造血功效衰竭而死亡；如输以供体骨髓或血液，小鼠能存活，并在受体小鼠脾中形成红系、粒系、巨核系细胞组成结节即脾集落，经证实全部这些细胞都是由单个细胞增殖分化而来，即脾集落形成单位（CFU-S）；如将脾结节细胞静脉注射给受体小鼠，该小鼠也能存活。证实了骨髓或血液中存在血液细胞祖先细胞。造血细胞及其检验第44页20世纪80年代出现了一系列体外检测造血干细胞试验方法，但只能部分证实造血干细胞自我更新和多向分化两个特征，如混合集落(CFU-Mix)培养，

高增殖潜能细胞(HPP-CFC）培养，

原始细胞集落形成细胞（CFU-Blast)培养，长久培养起始细胞（LTC-IC)检测等。造血细胞及其检验第45页（2）单克隆抗体法

利用FACS自动细胞分选系统分选出单个CD34+细胞亚群细胞----CD34+CD38+及CD34+CD38—，在无血清体系中加入各种细胞因子（如SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF及Epo）刺激，结果表明，CD34+CD38—单个细胞可形成原代集落，并可向红系、粒系、巨噬系、巨核系等细胞分化。证实了CD34+CD38—细胞性能靠近于造血干细胞，同时也证实了造血干细胞含有多向分化能力，还有试验表明，造血干细胞含有向淋巴细胞分化能力。造血细胞及其检验第46页当前造血干细胞表面标识还未确定。普通认为CD34阳性细胞含有长久重建造血能力，推测部分造血干细胞CD34阳性；CD34阳性CD38阴性细胞比CD34阳性细胞含有更强长久造血能力；AC133阳性细胞也被认为是早期造血细胞标志。明确造血干细胞表面标识不但含有主要理论价值，也有利于分离纯化高质量造血干细胞供临床应用。造血细胞及其检验第47页（二）造血祖细胞造血干细胞深入分化为各种造血祖细胞（hematopoieticprogenitorcell）。造血祖细胞是一类由造血干细胞分化而来，但失去自我更新能力过渡性、增殖性细胞群，过去称为定向干细胞。造血细胞及其检验第48页造血祖细胞有年纪结构，依据其分化能力，可分为多向祖细胞和单向祖细胞，多向祖细胞可深入分化为单向祖细胞。经过体外造血细胞半固体培养证实了造血祖细胞存在。造血细胞及其检验第49页产生红细胞祖细胞称为：

红细胞爆式集落形成单位（BFU-E)（早期）和红细胞集落形成单位(CFU-E)BFU-E造血细胞及其检验第50页

产生粒细胞和单核细胞祖细胞称为：

粒-单核细胞集落形成单位（CFU-GM）CFU-GM造血细胞及其检验第51页产生巨核细胞祖细胞称：

巨核细胞集落形成单位（CFU-Meg）CFU-Meg造血细胞及其检验第52页另外，产生嗜酸性粒细胞祖细胞称为嗜酸性粒细胞集落形成单位（CFU-Eo）；产生嗜碱性粒细胞祖细胞称为嗜碱性粒细胞集落形成单位（CFU-Bas）；产生T淋巴细胞祖细胞称为T淋巴细胞集落形成单位（CFU-TL）；产生B淋巴细胞祖细胞称为B淋巴细胞集落形成单位(CFU-BL)。这些祖细胞失去了自我更新能力，但有较强增殖和定向分化能力。造血祖细胞表面主要免疫标识已明确，所以，依据这一特征，可采取流式细胞术或其它免疫学技术来分析造血祖细胞，甚至能够使之分离纯化。造血细胞及其检验第53页（三）造血干／祖细胞临床应用造血干／祖细胞临床应用主要包括到造血干／祖细胞移植。当前造血干／祖细胞主要起源于骨髓、外周血和脐血，不一样起源造血干／祖细胞移植在临床上各有其优缺点。造血细胞及其检验第54页造血干／祖细胞移植主要应用于：1.血液系统恶性肿瘤，如急、慢性白血病等；2.血液系统非恶性肿瘤性疾病，如再生障碍性贫血、异常血红蛋白病、Fanconi贫血、难治性贫血等；3.实体肿瘤化疗后造血重建，如乳腺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤等；4.其它，如重症联合免疫缺点症、本身免疫性疾病、基因治疗等。造血细胞及其检验第55页

三、造血调控造血细胞增殖、分化受控于不一样调控系统，以保持各种血细胞数量和质量相对稳定。造血调控作用于血细胞发育每一阶段，体内许多原因参加了这一过程，其中细胞因子调控占主要地位。细胞因子（cytokines）是一组基因编码低分子量蛋白质细胞外信号分子，有是糖蛋白，有则不含糖基，在机体内含量极低，半衰期短，主要功效是在细胞间传递信息，从而影响造血活动。造血细胞及其检验第56页（一）集落刺激因子类(colony-stimulatingfactors,CSFs)CSFs在半固体细胞培养中能促进造血细胞集落形成。主要有以下几个：1.红细胞生成素（erythropoietin，EPO）

主要生物学功效是刺激红系祖细胞增殖和分化，以提升红细胞数量。2.粒细胞集落刺激因子(G-CSF)

除促进粒系祖细胞形成集落外，G-CSF可诱导一些白血病细胞株分化成熟，激活中性粒细胞吞噬功效，诱导早期造血干／祖细胞从场期进人细胞周期。造血细胞及其检验第57页3.粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)

GM-CSF除了促进中性粒细胞、单核细胞祖细胞增殖、分化成熟外，对成熟细胞也产生作用4.巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）

促进单核系祖细胞增殖和分化，激活巨噬细胞吞噬和分泌功效。5.多系集落刺激因子（multi-CSF）

促进造血干／祖细胞增殖、分化，促进多系集落生长。6.血小板生成素（thrombopoietin,TPO）促进造血干／祖细胞增殖、分化；促进巨核细胞集落形成。造血细胞及其检验第58页（二）白细胞介素（interleukin,IL)白细胞介素主要是白细胞产生信号分子，不但在免疫系统中传递信息，同时也参加造血系统造血调控，其主要生物学功效见（临床免疫学检验》。造血细胞及其检验第59页（三）其它细胞因子1.干细胞因子（stemcellfactor,SCF）

又称肥大细胞生长因子

促进肥大细胞生长；协同促进造血干／祖细胞增殖、分化。2．FLT-3配基(FLT-3ligand,FL)诱导处于静止期造血干／祖细胞进人细胞周期，促进其扩增。造血细胞及其检验第60页当前发觉对造血有调整作用细胞因子有近50种，它们对造血调控有正向和负向调整，一个细胞因子对一类细胞可能以正向调整为主，而对另一类细胞则可能是反向抑制，而且不一样浓度作用效果也不一样。大多数人类细胞因子能够经过基因工程制备，有已成功用于临床，如EPO较早地用来治疗各种贫血，尤其是与肾功效衰竭、化疗、肿瘤骨髓浸润相关贫血，取得了显著疗效；G-CSF应用于治疗化疗引发中性粒细胞降低症，骨髓移植和外周血造血干／祖细胞动员等。造血细胞及其检验第61页

第三节造血干／祖细胞体外培养技术

体内造血干／祖细胞在一个极复杂造血微环境中增殖、分化生成血液细胞。体外造血祖细胞培养就是在体外模拟体内生理环境，将从机体中分离出造血祖细胞进行培养，使之生存、增殖分化。造血细胞及其检验第62页