流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座

流式细胞术（FLOWCYTOMETRY）是利用流式细胞仪检测细胞或其它颗粒性物质物理、化学特征。它借鉴了荧光显微镜技术与血球计数原理,同时利用荧光染料,激光技术,单抗技术以及计算机技术发展,大大提升了检测速度与统计准确性,而且从同一个细胞中能够同时测得各种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新视角和强有力伎俩。

FCM在生命科学中应用,标志着细胞生物学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提供了精密、准确方法和仪器.

流式细胞术流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第1页EPICSXL流式细胞分析仪流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第2页FC500流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第3页惯用荧光染料特征荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PECy7488 755 免疫荧光 深红PerCP 488 670免疫荧光红TO488 525RNA染色绿流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第4页DualParameterHistograms流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第5页应用分类1、免疫表型分析2、DNA含量及细胞周期分析3、定量分析4、细胞功效分析5、凋亡研究6、其它方面流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第6页免疫表型分析1993年在波士顿召开人类白细胞分化抗原会议（leukocytedifferentiationantigen,HLDA）将CD抗原(clusterofdifferentiation)分为T细胞、B细胞、髓细胞、血小板、内皮细胞、自然杀伤细胞、活化抗原、黏附因子、细胞因子和细胞因子受体等九个组，确立了48种新抗原。1996年11月在神户召开第六届HLDA会议上，又有30各种新抗原被确认，CD编号已达166个，CD抗原有197种。7月，第七届人类白细胞分化抗原会议召开，CD抗原已达247种。流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第7页生物学我们想做什么?细胞群–淋巴细胞,单核细胞,粒细胞,血小板,etc.抗原组合多少?共表示?表示密度?抗原分布表面胞内流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第8页CD3CD8需要用多少标志来确证感兴趣细胞群?它们在细胞上分布是不是很近?它们是组成性表示和调整性表示?它们是否在不一样细胞上表示不一样?他们表示强还是弱?抗原表示:

ImportantforoptimalconfigurationCD3CD4CD3CD8流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第9页抗原分布:

Importantformethodoptimization表面,胞浆,核内是共同检测还是分别检测?表面胞浆核内CD3,CD4,CD8,tetramercytokinesDNACD3,4,8,tetramer+CytokinesCD3,4,8,tetramer+DNACytokines+DNACD3,4,8,tetramer+Cytokines+DNA流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第10页CD系列在免疫学中常被用于：

（1）CD抗原基因克隆，新CD抗原及新配体发觉；（2）CD抗原功效与结构关系（3）细胞激活路径和膜信号传递；（4）细胞分化过程中调控；（5）细胞亚群功效。

流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第11页1.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态2.白血病/淋巴瘤免疫分型3.HLA组织配型及HLA与一些疾病关系4.干祖细胞定量及成份分析.5.其它:血小板PAIg：粘附分子;TCR多态性检测;肿瘤癌基因及抑癌基因蛋白产物检测;细胞内酶;耐药蛋白分析等等。临床与科研常见应用流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第12页淋巴细胞亚群T淋巴细胞(CD3+)名称功能CD3+CD4+辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫

CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD8+抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异源细胞

CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化T细胞在T细胞恶性增生时升高

CD3+CD4-CD8-有调整功效T细胞,其表示/T细胞受体(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚/静止T淋巴细胞当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞祖细胞时此细胞亚群较低CD45RA-CD45RO+记忆性T淋巴细胞

病菌感染时升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化T细胞,感染时升高感染时升高流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第13页淋巴细胞亚群活化T淋巴细胞名称功能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+活化辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+活化辅助性/诱导性T细胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染患者中增加;其增加意味着HIV患者预后较差B淋巴细胞(19+)CD19+CD23+活化B细胞过敏患者中升高

CD19+CD5+在本身免疫性疾病中升高CD19+CD5+CD23+慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞

NK细胞CD3+CD(16+56)+本身免疫性疾病时降低,而病毒感染时升高CD3+CD57+CMV(巨细胞病毒)感染强烈征兆流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第14页淋巴细胞亚群与疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK本身免疫性疾病系统性红斑狼疮类风湿性关节炎本身免疫性溶血性贫血重症肌无力免疫缺点病爱滋病病毒感染传染性单核细胞增多症慢性活动性肝炎活动性肝硬化肿瘤消化道癌,肝癌,肺癌再生障碍性贫血粒细胞降低症流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第15页监测细胞免疫状态

1.CD4+、CD8+T细胞降低：见于r免疫球蛋白缺乏症、胸腺

发育不良、严重联合免疫缺点病。2.CD8+T细胞增多见于病毒感染：HBV、CMV、EB等。3.CD4+/CD8+百分比异常：进展期AIDS：CD4+细胞降低，CD8+细胞能够正常、增高或降低，比值下降；身免疫性疾病，如多发性硬化，CD4+/CD8+升高，CD8+降低；SLE病人淋巴细胞改变能够反应该病活动情况和器官侵犯程度。

ABMT后免疫重建期间可有CD4降低，比值下降。风湿性关节炎关节液中CD4+CD29+细胞增多。多发性硬化（MS）、SLE患者外周血CD4+CD45RA+细胞降低。

流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第16页

4，CD3/HLA-DR：同时计数外周血静止T细胞（CD3+HLA-DR-）、B细胞（CD3-HLA-DR+）及活化T细胞（CD3+HLA-DR+）。

5，CD3/CD16+56：计数总NK细胞群（CD3-CD[16+56]+）。NK细胞是机体抗肿瘤、寄生虫、病毒等感染主要免疫原因，也参加第II型超敏反应和移植物抗宿主反应，IL-2治疗后，外周血NK细胞增加。

6，移植后免疫监测：测定细胞表面活化抗原表示,能够预测移植排斥和移植后感染:

CD25+高于正常5--10%,表明即将发生或已发生排斥;

CD4/CD8比值下降提醒并发凶险感染,比值<0.2必须停用免疫抑制剂.

CD2+HLA-DR+增加5--10%,且不伴有CD25增加,提醒巨细胞病毒感染.流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第17页变态反应性疾病CD19与CD23检测判别支气管炎与哮喘CD203变态反应性疾病CD203增强CD63CD63与支气管炎疾病进程黏附分子流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第18页

白血病免疫分型价值确定ALL细胞类型（B细胞或T细胞）和ALL分化阶段。判定AML特征。对形态学上未分化急性白血病有利于判定细胞类型。诊疗一些少见类型白血病。如：M6、M7、M0等。流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第19页

诊疗双表型/混合细胞型急性白血病。判别诊疗ALL伴有髓系抗原表示（My+）或AML伴有淋系抗原表示（Ly+）。判别急性白血病与其它造血系统和非造血系统恶性肿瘤。依据一些特殊免疫表型特征诊疗与某核型异常相关亚型。如：M3/t(15;17);M2/t(8;21);M4Eo/inv(16)等。流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第20页HLA-B27检测

外周血HLAB27表示及其表示程度与强直性脊柱炎发生有很大程度相关性.循环血中活化血小板（CD62P、CD63）：

糖尿病伴微血管病变、冠心病、高血压病、高脂血症、脑血栓形成、短暂性脑缺血发作、脑动脉硬化患者活化血小板百分率和绝对值显著高于正常人。而糖尿病无微血管病变、周围血管病变以及深静脉血栓形成患者活化血小板水平与正常人无显著差异。PTCA后24小时发展成急性血管闭塞或高度再狭窄患者活化血小板CD62p、CD63增多，能够用于预测PTCA后急性缺血再发作危险性。

流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第21页PNH(阵发性睡眠性血红蛋白尿)流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第22页HbF(胎儿血红蛋白)检测流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第23页HbF(胎儿血红蛋白)检测流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第24页热门研究抗原特异性T细胞检测树突状细胞（DC）循环微转移肿瘤细胞TLR1、TLR2、TLR4等流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第25页MHCTetramerTechnology流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第26页微转移肿瘤细胞灵敏度:10-7流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第27页

临床应用疾病诊疗:为疾病诊疗提供直接或支持诊疗依据免疫调整：细胞因子/受体相互作用共刺激分子受体/配体相互作用

发病机理：肿瘤发病与机体免疫力低下、以及信号传递障碍相关药品/疫苗效果评价：肿瘤生物治疗时机选择、以及效果监测免疫状态评价：移植、放化疗等.流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第28页细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)各个时期，DNA含量随各时相展现出周期性改变。经过核酸染料标识DNA，并由流式细胞仪进行分析，能够得到细胞各个时期分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞周期分布及细胞增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，对细胞周期进行准确分期：G0、G1、S、G2、M.DNA含量及细胞周期分析流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第29页G2MG0G1s0

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8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第30页0

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80010002N4NCountsG0/G1G2/MS异倍体PI荧光强度(DNA含量)流式DNA周期示意图流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第31页淋巴瘤组织学分级与DNA倍体及

S期细胞关系HistologyDNAAnalysisS期比值(%)Low-gradeDiploid/Aneuploid1~5Intermediate-gradeFrequentlyAneuploid5~15High-gradeFrequentlyAneuploid>15流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第32页

依据Workingformulation之分类，Low-gradeNHL中有47%为Aneuploid在Intermediate-gradeNHL中有71%为Aneuploid；而High-gradeNHL中有90%为Aneuploid

DNA含量；很显然使用FCM也有利于NHL诊疗与分类，不过Aneuploid是否对预后有影响，则仍有待研究。有些人认为高SPF是最主要不良预后指标。流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第33页癌前病变

人体组织细胞在转化过程中，均伴伴随细胞DNA含量异常改变，癌前病变癌变率与病变增生程度一致，而增生程度与DNA含量异常改变又呈平衡关系，FCM经过准确确定DNA含量，能对癌前病变性质和发展趋势作出判断，有利于癌变早期诊疗。

DNA非整倍体出现可能是恶变细胞主要标志，当前病理学尚无法从中发觉癌变和即将癌变细胞，而FCM检测中细胞DNA非整倍体出现可做为一个有价值参数。流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第34页1.肿瘤早期诊疗。2.肿瘤良恶性判断。3.观察细胞增殖状态及周期分布。4.疗效监测流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第35页细胞功效分析

1.吞噬功效试验

2.氧暴发试验3.依据T淋巴细胞分泌细胞因子不一样将CD4+或CD8+分为介导细胞免疫I型细胞和介导体液免疫II型细胞.4.药品泵功效检测

5.NK细胞肿瘤杀伤活性检测6.血小板粘附,聚集功效检测：

纤原或GPIIb-IIIa上纤原受体缺点均可引发血小板聚集障碍而出血。应用纤原单抗(如SZ65)及ADP等诱导剂，在FCM上观察纤原结合百分率及荧光强度，可为该疾病诊疗提供参考依据.流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第36页细胞凋亡细胞凋亡是细胞一个基本生命现象，贯通于个体生长、发育直至死亡整个生理过程。它与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡作用，且在胚胎发育、免疫系统克隆选择、神经系统、造血系统发育过程中饰演至关主要角色；其病理学作用可包括癌症、本身免疫疾病、HIV及退行性神经疾病如Alzheimer和Parkinson病等。正因为如此，与其相关基因和分子研究成为当今生命科学领域一个焦点流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第37页Introductionofapoptosispathway流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第38页细胞凋亡研究

1.判别凋亡与坏死:AnnexinⅤ/PI2.测定凋亡率:AnnexinⅤ、Apo2·7、TUNEL3.研究凋亡触发机制：Caspase、Fas及FasLbcl-2/bax流式细胞术在临床和科研中的应用专家讲座第39页细胞膜非对称性和通透性检测流式细胞术在临床和科