新版基因工程工具酶

供体细胞载体分子外源DNA外源基因分离酶切酶切连接转化扩增DNA重组分子受体细胞判定与表示重组转化子工程菌或细胞蛋白产物工程菌或细胞培养重组产物分离纯化新版基因工程工具酶第1页基因克隆与表示基因克隆基本元件PCR及文库克隆法DNA重组及转化技术转化子筛选与判定原核生物表示系统新版基因工程工具酶第2页一基因工程基本元件

------工具酶限制性内切酶DNA连接酶DNA聚合酶逆转录酶

DNA修饰酶新版基因工程工具酶第3页

第一节限制性内切酶定义:能够识别和切割双链DNA(dsDNA)分子内特异核苷酸次序核酸内切酶,叫做限制性核酸内切酶.主要特征I型II型III型切割位点距寄主特异性位点最少数百bp部位可能随机切割位于寄住特异性位点或两侧距寄住特异性位点3’端24-26bp处序列特异切割不是是是三种类型核酸内切酶特征差异新版基因工程工具酶第4页一、II型限制性内切酶切割类型1、平齐末端（Bluntend）HindII切割反应SmaI切割反应新版基因工程工具酶第5页2.1产生5’粘性末端

5’-GA-A-T-T-C-3’

3’C-T-T-A-A-G-5’

5’-G-3’5’-A-A-T-T-C-3’

3’-C-T-T-A-A-5’3’-G-5’

2.2产生3’粘性末端

5’-C-T-G-C-A-G-3’

3’-GA-C-G-T-C-5’

5’-C-T-G-C-A-3’5’-G-3’

3’-G-5’3’-A-C-G-T-C-5’

EcoRI＋＋PstI2、粘性末端（Stickyend）新版基因工程工具酶第6页新版基因工程工具酶第7页同尾酶

这一类限制酶起源各异，识别靶序列也不相同，但产生相同粘性末端。G-G-A-T-C-CC-C-T-A-G-GBamHIT-G-A-T-C-AA-C-T-A-G-TBclIA-G-A-T-C-TT-C-T-A-G-ABglIIG-A-T-CC-T-A-GSau3AIU-G-A-T-C-YY-C-T-A-G-UXhoIIU表示嘌呤（A或G）Y表示嘧啶（T或C）5‘-G-A-T-C3’--3‘C-T-A-G-5’+二、II型限制性内切酶主要概念新版基因工程工具酶第8页酶星号活性

当酶切条件改变时，酶专一性可能会降低，以至于同一个酶可识别和切割多个位点。低盐（50mM）、高pH（>8）、高甘油浓度EcoRI*EcoRIG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GG-A-A-T-T-AC-T-T-A-A-TA-A-A-T-T-CT-T-T-A-A-GG-A-G-T-T-CC-T-C-A-A-G新版基因工程工具酶第9页双酶切方法同时双酶切分步双酶切新版基因工程工具酶第10页三、限制性内切酶分析方法/rebase/rebase.html新版基因工程工具酶第11页新版基因工程工具酶第12页新版基因工程工具酶第13页新版基因工程工具酶第14页新版基因工程工具酶第15页DNA连接酶

定义：能够催化双链分子中相邻3’-OH和5’-P末端之间形成磷酸二酯键,使DNA分子连接起来酶.一、种类

1.1T4-DNA连接酶

—从T4噬菌体感染大肠杆菌提取1.2大肠杆菌DNA连接酶新版基因工程工具酶第16页二、DNA连接酶连接范围

1.粘性末端DNA连接2.缺口填补3.平末端DNA连接5’3’3’5’5’3’3’5’PPOHOH5’3’3’5’POHRNADNA5’3’3’5’OHOHPP5’3’3’5’5’3’3’5’Mg2+,ATPMg2+,ATPMg2+,ATPT4-DNA连接酶T4-DNA连接酶T4-DNA连接酶T4-DNA连接酶各种催化反应活性新版基因工程工具酶第17页三、DNA连接酶连接条件

1.双链DNA分子2.含有3’-OH和5’-P3.缺口处不缺核苷酸缺失核苷酸裂口丢失磷酸二酯键缺口3’5’连接酶封闭缺口连接酶无法封闭缺口无活性（a）（b）新版基因工程工具酶第18页五、T4DNA连接酶反应条件10×T4DNALigaseBuffer2.5μl

DNA片段*约0.3pmol

载体DNA**约0.03pmol

T4DNALigase1μlddH2Oupto25μl

反应温度16度，连接过夜。*DNA片段摩尔数应控制在载体DNA摩尔数3～10倍。新版基因工程工具酶第19页DNA聚合酶特点：

1.以四种脱氧核糖核苷酸为底物

2.需模板DNA；

3.需引物；

4.新链合成方向为5’-3’DNA聚合酶新版基因工程工具酶第20页三、DNA聚合酶活性1.5’→3’聚合酶活性2.5’→3’外切酶活性

3.3’→5’外切酶活性

裂口缺口新版基因工程工具酶第21页四、Klenow酶1.起源：

DNA聚合酶Ⅰ枯草杆菌蛋白酶C端(67kd)+N端（35kd）

Klenow5’→3’聚合3’→5’外切5’→3’外切新版基因工程工具酶第22页2.Klenow酶三维结构新版基因工程工具酶第23页5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’********(a)(b)(c)(d)(e)(a)DNaseI处理双链DNA分子(b)带有3’-OH末端单链缺口(c)polⅠ从5‘-P移去一个核苷酸(d)polⅠ将32P标识核苷酸参入取代被移去核苷酸(e)重复(c)(d)步骤，缺口沿5’-3‘方向移动，形成32P标识核苷酸合成DNA链五、DNA聚合酶应用

1.制备DNA分子杂交探针(缺口平移Nicktranslation)

新版基因工程工具酶第24页五、DNA聚合酶应用

2.制备DNA分子杂交探针(随机引物法)

新版基因工程工具酶第25页五、DNA聚合酶应用

4.测序（T7DNA聚合酶）(Sanger双脱氧链终止法）

5‘→3’聚合，连续反应时间最长3‘→5‘外切，是DNA聚合酶Ⅰ

1000倍。2,3-双脱氧A,C,G,T核苷三磷酸(称为ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP)

新版基因工程工具酶第26页5.1起源：水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT15.2活性：聚合最适温度为75-80℃，不具3’→5’外切酶活性，具5’→3’外切活性。五、DNA聚合酶应用5.PCR反应（TaqDNA聚合酶）

新版基因工程工具酶第27页反转录酶（reversetranscriptase）

酶类别肽链5’-3’聚合活性RNaseHAMVα（62KDa)β（94KDa)++++M-MLV84KDa++一、起源：商品反转录酶有两种来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)。来自Moloney鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶二、结构和活性：新版基因工程工具酶第28页①依赖RNADNA聚合酶活性

T

T

T

T-OHT

T

T

TAGACAGAAAAUCUGUCAAAAUCUGUC逆转录酶Mg++

4dNTP②依赖于DNADNA聚合酶活性

5’

3’

ssDNA5’

3’

逆转录酶Mg4dNTP

③外切RNA酶活性

(RNA酶H)

+寡聚RNA片段逆转录酶RNA/DNAssDNARNAOH新版基因工程工具酶第29页三、用途新版基因工程工具酶第30页一、单链核酸酶（S1/Bal31Nuclease)

带切口双链DNADNA修饰酶新版基因工程工具酶第31页2.Bal31单链核酸酶用途

2.1DNA缺失突变(Bal31)

Bal31单链核酸酶含有单链核酸内切酶和双链DNA3’、5’末端同时降解活性。5'PP5'3'HOOH3'新版基因工程工具酶第32页新版基因工程工具酶第33页末端转移酶1.起源：

又称脱氧核苷酸转移酶，自牛胸腺中分离。

2.活性：催化dNTP掺入DNA3′-OH末端，形成同聚物末端；反应不需模板DNA，需Co2+。新版基因工程工具酶第34页①ssDNA3’-OH加尾

②dsDNA3’-OH加尾(包含平末端加尾)

5’AACC-OH5’AACCTTTT转移酶Mg++、dTTP5’AACC-OH3’TTGG5’AACCTTTT3’TTGG转移酶Co、dTTP3.用途:

①载体和DNA加上同聚“尾巴”以形成粘性末端②DNA3’-OH端同位素标识