病毒感染实验诊断

病毒感染实验诊断病毒感染实验诊断第1页然后依据可疑病毒生物学特点、机体免疫应答和临床过程，以及病人当前所处时机，确定试验诊疗方法。病毒感染实验诊断第2页1.对潜伏期短，发病时尚无抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。病毒感染实验诊断第3页2.对潜伏期超出十天感染，可检测特异性IgM抗体来进行早期快速诊疗，及区分首次和再次感染。病毒感染实验诊断第4页3.对可在体内形成连续感染或潜伏感染病毒，可检测急性期和恢复期双份血清IgG抗体有没有4倍以上升高，或直接检测病毒核酸。病毒感染实验诊断第5页4.对原因不明或有新病毒感染时，应采集标本进行病毒分离，同时应采取双份血清以确认分离病毒为病原体。病毒感染实验诊断第6页5.对同一症状可有各种病毒引发情况，应同时检测几个相关病毒病毒颗粒、抗原或抗体，6.对由多个型别组成病毒可测定它们共同抗原。病毒感染实验诊断第7页第一节标本采集与运输

一、标本采集1.采样时间尽可能在发病早期，急性期或患者人院当日进行。

病毒感染实验诊断第8页2.标本种类选择依据临床感染症状及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择对应部位采取标本。病毒感染实验诊断第9页常见分离病毒标本选择

病毒咽拭子粪便血液脑脊液唾液

组织

柯萨奇A和B组

+++心

单纯疱疹病毒

+脑膜

腮腺炎病毒

+++流感病毒

+轮状病毒

+HAV+HIV+

精液病毒感染实验诊断第10页3．常见标本采集方法

(1)血液：以无菌取抗凝血10ml。抗凝选取100n／ml肝素钠。用于分离CMV、HSV，、黄病毒、EBV、HIV-1及新生儿肠道病毒。病毒感染实验诊断第11页(2)脑脊液：以无菌取脑脊液

1～2ml，冰浴马上送检。在4℃可存放72h。用于分离柯萨奇病毒、ECHO病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。病毒感染实验诊断第12页(3)宫颈或阴道拭子：采取病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm停留5秒取出，冰浴马上送检。用于分离HSV、CMV。病毒感染实验诊断第13页(4)粪便标本：取2～4ｇ粪便加

10ml运输液马上送检，用于分离腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。病毒感染实验诊断第14页(5)含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。用于分离流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、

RSV等。

病毒感染实验诊断第15页(6)喉拭子：用压舌板防止唾液污染，用拭子采取咽喉部表面。用于分离腺病毒、CMV、肠道病毒、HSV、流感病毒等。病毒感染实验诊断第16页(7)尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸人尿道4cm转动3次，以获得较多上皮细胞，用于分离

CMV和HSV。(8)尸检标本：死亡后尽早采集各种器官，分别使用器械和容器。病毒感染实验诊断第17页二、标本运输和保留

病毒抵抗力弱，室温中轻易灭活，用于分离培养标本要尽快送检，4℃下数ｈ或-70℃。冻存液中加入甘油或二甲基亚砜(DMSO)等作保护。病毒感染实验诊断第18页病毒传送培养基以Hanks液为基础加灭活小牛血清。为抑制细菌生长加青霉素100U／ml和链霉素100μg／ml，为了抑制真菌生长加入2．5μg／ml二性霉素B或40μg／ml制霉菌素。病毒感染实验诊断第19页第二节病毒分离与判定

一、病毒分离方法1.组织细胞培养依据细胞起源、特征和传代次数分为：(1)原代细胞培养：将细胞悬液。加入营养液培养。形成单层细胞，称之为原代细胞。病毒感染实验诊断第20页(2)二倍体细胞株：仍保持二倍体特征。寿命普通为40～50代，如人胚肺细胞。广泛用于病毒分离和疫苗制备。病毒感染实验诊断第21页(3)传代细胞系：来于肿瘤细胞，染色体特征类似肿瘤细胞。常见有些人宫颈癌细胞(Hela)、人喉上皮癌细胞(Hep-2)。病毒感染实验诊断第22页2．鸡胚接种鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒较为理想材料。病毒感染实验诊断第23页3．动物接种动物对病毒敏感性是不一样，选择适当动物十分主要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常见于分离病毒。病毒感染实验诊断第24页常见于病毒分离细胞

细胞种类可分离病毒

原代细胞

非洲绿猴肾细胞人单核细胞人胚肾、肺细胞恒河猴猕猴肾细胞HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、风疹病毒

HIV、HTLV、HHV-6腮腺炎病毒、腺病毒ECHO、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A、B组、RSV

二倍体细胞株

人胚肺成纤维细胞株

WI-38、MRC—5CMV、VZV、鼻病毒腮腺炎病毒、腺病毒

传代细胞系

HelaHep-2Vero

柯萨奇A、B组、RSV腺病毒、RSVHSV、RSV、风疹病毒、轮状病毒、麻疹病毒病毒感染实验诊断第25页三、病毒判定

必须经过全方面了解其特征才能得到判定。1.依据临床特点，流行病学资料，标本起源，大致了解病毒一些特征，有利于确认病毒种类。病毒感染实验诊断第26页2.动物感染范围及特点病毒感染动物范围、发病潜伏期。3.细胞培养特点。综合上述资料作出判定。病毒感染实验诊断第27页病毒判定方法1.细胞培养结果观察

病毒增殖后造成细胞发生:①细胞病变效应(CPE)。细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；病毒感染实验诊断第28页②不出现细胞病变现象。③细胞培养液pH改变。病毒感染实验诊断第29页2.中和试验病毒与特异性抗体进行免疫反应，使病毒失去感染性，在细胞培养和活机体内不出现病变试验。常见细胞培养进行中和试验。如果特异性抗体能中和病毒，使之失去感染性，不出现细胞病变效应，则该病毒为特异性抗体同型病毒，病毒感染实验诊断第30页用于病毒分型诊疗最具敏感和准确性。也可用于检验患者病后或人工免疫后，机体血清中抗体增加情况。

病毒感染实验诊断第31页3.空斑或蚀斑形成试验

空斑是指在单层细胞中被病毒感染引起死亡细胞区域，周围被活细胞包围。普通而言，一个空斑是由一个感染性病毒颗粒感染所引发。不一样病毒引发空斑形态和大小不一样。可进行病毒颗粒计数、纯化，结合中和试验可进行病毒判定。病毒感染实验诊断第32页4.干扰现象

一些病毒间存在着干扰现象，如一些型别鼻病毒能干扰以后进入副流感病毒增殖，从而阻抑后者红细胞吸附作用。病毒感染实验诊断第33页5.红细胞吸附及吸附抑制试验正粘病毒，副粘病毒感染宿主细胞，病毒增殖后产生细胞病变，但在细胞表面含有病毒一些抗原成份(血凝素)，能吸附鸡、豚鼠或猴红细胞。病毒感染实验诊断第34页可作为初步判定。假如在培养瓶中加入对应血凝素抗血清后，不出现红细胞吸附现象，是为红细胞吸附抑制试验阳性，可作为病毒判定依据。病毒感染实验诊断第35页4．血凝试验及血凝抑制试验

一些病毒可与一定种类哺乳动物或禽类红细胞产生血凝现象。加入对应血凝素抗体可抑制血凝现象发生，是为血凝抑制试验。可作为病毒型别确定依据。病毒感染实验诊断第36页5．病毒大小及形态

可用电子显微镜观察病毒大小及形态。病毒感染实验诊断第37页6．核酸类型判别及序列测定

利用5—溴-2-脱氧尿苷(BUDR)抑制DNA复制特征，在细胞培养液中加入该物质，可抑制DNA病毒复制和增殖，抑制细胞病变出现，但对

RNA病毒无抑制作用，以此判断病毒核酸类型。病毒感染实验诊断第38页对病毒核酸特异序列或全序列碱基排列测定或DNA杂交、DNA-RNA杂交来判定病毒。病毒感染实验诊断第39页7．耐酸试验

肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在酸性环境下易被灭活。

病毒感染实验诊断第40页8．乙醚敏感试验

病毒外围如有类脂包膜，则易被乙醚破坏，而失去感染性，不能感染细胞。可作为病毒是否具有类脂包膜依据，也可用氯仿或去胆酸钠代替乙醚进行试验。

病毒感染实验诊断第41页9．免疫荧光抗体染色

将感染细胞固定，用特异抗血清荧光标识染色，在荧光显微镜下，可见细胞内荧光，即可确定型别。病毒感染实验诊断第42页第三节病毒感染快速诊疗

经过测定病毒特异标志成份，如特殊形态、特异抗原成份及病毒核酸，早期确认病毒感染，是病毒学诊疗重大发展。病毒感染实验诊断第43页一、形态学检验

1．光学显微镜观察病毒感染细胞出现包涵体。依据特点可作出辅助诊疗。狂犬病病毒在脑细胞出现嗜酸性圆形或椭圆形包涵体，称为内基小体。巨细胞病毒在上皮细胞细胞核内出现周围绕有一轮晕似“猫头鹰眼”样大型嗜酸性包涵体。病毒感染实验诊断第44页2．电子显微镜检验

(1)电镜直接检验：早期病毒感染标本病毒颗粒。如“秋季泻”患儿粪便中轮状病毒、甲肝患者粪便中HAV，疱疹病毒疱疹液，

HBV患者血清，均可观察到特征性病毒颗粒。

病毒感染实验诊断第45页(2)免疫电镜检验：在标本中加入抗体。使病毒聚集成块负染观察，更易发觉病毒体，灵敏度可提升100倍。病毒感染实验诊断第46页

二、病毒抗原检测

病毒抗原是病毒特异性标志，经过免疫学技术检测标本中特异性抗原存在，能够早期诊疗病毒感染。病毒感染实验诊断第47页1．免疫荧光技术适合于型别少，细胞培养难以成功病毒，如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒等。肝活检组织中肝炎病毒、神经组织中单纯疱疹病毒、脑组织中狂犬病毒或其它脱落细胞和活检组织中病毒抗原检测。病毒感染实验诊断第48页2．酶免疫技术有酶免疫组化和酶免疫吸附(ELlSA)试验法。测定标本中游离抗原或抗体。如检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，HIV感染病人P24

抗体等。病毒感染实验诊断第49页3.其它技术如固相放射免疫技术、发光免疫分析技术、胶体金标识免疫层析技术等。病毒感染实验诊断第50页三、早期抗体检测

检测病毒感染机体后产生早期特异性抗体，如测定特异性IgM能够快速明确诊疗各种病毒引发新生儿先天性感染，测定HAV感染后抗HAVIgM抗体能够明确诊疗HA等。病毒感染实验诊断第51页四、病毒核酸检测

只要有完整特异基因片段存在，就可进行诊疗。病毒感染实验诊断第52页1．斑点杂交法

将待测DNA或RNA直接点在杂交滤膜上，变性后，用标识核酸探针进行杂交。用32p或131I同位素标识探针经过放射白显影，可直接观察。现用地高辛、生物素等非同位素物质标识，然后采取酶反应或酶免疫技术进行检测，已被越来越多试验室广泛使用。病毒感染实验诊断第53页2．固相杂交技术

将核酸探针包被聚苯乙烯微孔板中，加人待测核酸序列和标识指示探针杂交液中进行杂交，洗涤后，用酶免疫技术进行检测。病毒感染实验诊断第54页3.原位分子杂交技术

在细胞原位暴露DNA或RNA，加入标记特异核酸探针进行杂交。经过显色技术可显示特定杂交探针在细胞内位置和核酸数量。病毒感染实验诊断第55页4.Southern印迹和Northern印迹法

Southern印迹法用于DNA杂交。提取

DNA,用内切酶切割后，进行琼脂糖电泳按分子量使DNA分开，将DNA移至硝酸纤维膜上，用标识探针进行杂交。能够检测病毒DNA特异序列。

Northern印迹法用于RNA杂交分析。将琼脂糖电泳后RNA移至DBM膜上，用标记探针进行杂交。用于检测RNA或mRNA。病毒感染实验诊断第56页5．聚合酶链反应(PCR)

选择病毒特异保守片段作为靶基因，进行引物设计和扩增可诊疗