酶联免疫测定法

酶联免疫测定法酶联免疫测定法第1页

经典化学分析方法（滴定分析、重量分析、简单吸光光度法）是以简单离子或分子为检测对象常量或微量分析，面对生物体系成份复杂且待测物浓度较低测试条件则往往无能为力。

于是，一系列针对生物体系中化学成份测量方法应运而生。免疫化学分析即其主要组员，它将免疫学知识与化学分析伎俩有机结合，为生命体系中高特异性、超微量分析提供了处理方法。酶联免疫测定法第2页基础概念：

抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引发动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应物质。

抗体：是由抗原刺激动物免疫系统后，由免疫系统产生分泌能和对应抗原发生特异性结合免疫球蛋白。酶联免疫测定法第3页1.1抗原抗体反应基础特征：

1.1.1可逆性

抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物过程是一个动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab

高亲和力抗体抗原结合点与抗原决定簇在空间构型上非常适合，二者结合牢靠，不易解离。解离后抗原或抗体均能保持原有结构和活性。酶联免疫测定法第4页1.1.2特异性

抗原抗体结合发生在抗原决定簇与抗体结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，含有高度特异性。

测定某一特定物质，而不需先分离待检物。

酶联免疫测定法第5页1.1.3最适百分比

酶联免疫测定法第6页1.1.4敏感性化学比色法敏感度为mg/ml水平酶反应测定法敏感度约为5-10μg/ml标识免疫敏感度可提升数千倍，达ng/ml水平比如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。酶联免疫测定法第7页第一章概述1标识免疫技术：将试剂抗原或试剂抗体用能够微量检测标识物（比如放射性核素、荧光素、酶等）进行标识，试剂与标本中对应抗体或抗原反应后，无须测定抗原抗体复合物本身，而是测定复合物中标识物，这种免疫技术，称为标识免疫技术.

2标识免疫技术分类：⑴按标识物分类：同位素标识荧光素酶标识等等酶联免疫测定法第8页放射免疫技术发光免疫技术酶免疫技术三大经典标识技术三大经典标识技术酶联免疫测定法第9页放射免疫技术放射免疫技术是利用放射性核素可探测灵敏性、准确性，抗原抗体反应特异性组合而创建一类免疫测定技术医学生物学超微量分析里程碑。放射免疫技术分为：放射免疫分析免疫放射分析酶联免疫测定法第10页酶联免疫测定法第11页放射免疫分析测定原理Ag+AbAg–Ab+Ag（待测品）

Ag–AbRR将标识抗原（Ag*）和未标识抗原（Ag）与特异性抗体（Ab）相混合，结果形成标识和未标识抗原抗体复合物。标识和未标识抗原竞争与抗体进行结合现象，成为竞争性抑制作用。酶联免疫测定法第12页Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag量大于Ab结合位点，二者经过竞争方式与Ab结合；伴随Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物放射量降低,二者改变成函数关系。

酶联免疫测定法第13页放射免疫技术应用放射免疫技术特异性强、精密度好，灵敏度高（10-9-10-15g/L），对半抗原和抗原测定及仪器设备条件要求不高，是基层医院测定超微量物质主要伎俩，常见于各种激素、微量白蛋白、肿瘤标识物和药品等微量物质检测。酶联免疫测定法第14页放射免疫技术缺点放射性核素半衰期短，试剂使用期短，通常为一个月。因为标识物不停改变，使试剂批间、批内差异大，标准曲线无法保留备用。放射免疫使用放射性核素标识，需要一定防护及废物处理办法。结果测定依靠时间累计，最少每一样本一分钟。无法进行自动化分析酶联免疫测定法第15页第二节酶联免疫法免疫酶技术：酶标识试剂制备轻易、稳定、使用期长，免疫酶技术敏感性靠近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单仪器作定量测定，所得结果比较客观。酶联免疫测定法第16页一、酶免疫测定法概念和分类把抗原抗体免疫反应和酶高效催化作用原理有机地结合起来。将酶与抗体或抗原用交联剂结合起来，形成酶标抗体或抗原。这种抗原或抗体与体内或者固相上抗体或抗原特异性结合，加入对应酶底物时，底物被酶催化生成有色产物，依据呈色深浅来判断待测抗原或抗体活性和浓度。

酶联免疫测定法第17页酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原定位

液体标本中抗原或抗体定性和定量酶联免疫测定法第18页均相法：不需分离复合物与游离标识物即可直接测定方法。异相法则需分离后测定酶联免疫测定法第19页

1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)

。ELISA现在已成为当前分析化学领域中前沿课题，它是一个特殊试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)基础上发展起来一个新型免疫测定技术。

酶联免疫测定法第20页ELISA基础原理和方法ELISA种类和改变ELISA特点ELISA应用实例ELISA酶联免疫测定法第21页ELISA基础原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间疏水性个别相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可经过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与对应抗原或抗体结合后，可依据加入底物颜色反应来判定是否有免疫反应存在，而且颜色反应深浅是与标本中对应抗原或抗体量成正百分比，所以，能够按底物显色程度显示试验结果。用于定量测定。酶联免疫测定法第22页在这种测定方法中有3种必要试剂：①固相抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标识抗原或抗体（标识物）③酶作用底物（显色剂）测定对象能够是抗体也能够是抗原酶联免疫测定法第23页标本标本酶标抗体底物显色有色为阳性显色有色为阳性酶标二抗底物酶联免疫测定法第24页测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一个抗体（抗原）与酶结合成偶联物（标识物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上抗原（抗体）反应结合后，再加上酶对应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。酶联免疫测定法第25页颜色反应深浅与对应抗体或抗原量成正比，所以可借助于颜色反应深浅来定量抗体或抗原。

这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也能够用分光光度计（酶标仪）加以测定。

其方法简单，方便快速，特异性强。酶联免疫测定法第26页ELISA种类和改变

（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（假阴性）（五）捕捉法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素ELISA

酶联免疫测定法第27页1.双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待测抗原，再加酶标抗体，加底物显色应用：这种方法欲测抗原必须有两个能够与抗体结合部位，因为其一端要包被于固相载体上抗体作用，而另一端则要与酶标识特异性抗体作用。所以，不能用于分子量小于5000半抗原之类抗原测定。

乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA检测抗原方法酶联免疫测定法第28页酶联免疫测定法第29页1、已知抗体包被于载体表面3、加酶标抗体与抗原结合4、加酶作用底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包被于载体表面2、加待检物无抗原与抗体结合3、加酶标抗体无抗原结合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY酶联免疫测定法第30页取得待分析物未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留蛋白结合位点洗涤并除去未结合封闭蛋白加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去其它未结合物质加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标识抗体复合物彻底洗涤未结合酶标抗体加底物进行酶催化反应依据颜色反应程度进行该抗原定性或定量测定酶联免疫测定法第31页2.间接法方法

用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点一个酶标抗抗体检测各种与抗原对应抗体应用

常见于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等测定ELISA检测抗体方法酶联免疫测定法第32页酶联免疫测定法第33页1、已知抗原吸附于载体表面2、加待检物无抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig与抗体结合4、加酶作用底物产生颜色1、已知抗体吸附于载体表面2、加待检物有抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig抗体4、加酶作用底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+酶联免疫测定法第34页包被固相载体:用已知抗原包被固相载体加待检标本:使对应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关物质加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合酶标抗抗体加底物显色依据颜色反应程度进行该抗原定性或定量测定酶联免疫测定法第35页竞争法

方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇小分子半抗原（药品、激素等）ELISA检测抗原方法酶联免疫测定法第36页洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用底物不显色或显色弱3、加酶作用底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合YE酶联免疫测定法第37页用已知特异性抗体包被固相载体测定管加待测抗原和一定量酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合分别洗涤除去未结合成份加底物显色分别测定两管吸光度值，依据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量酶联免疫测定法第38页

对照管因为只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合酶标抗原量降低。所以，加入底物后显色反应较弱。酶联免疫测定法第39页酶联免疫测定法第40页ELISA方法类型及应用双抗体夹心法：检测抗原最常见方法，适合用于检测两个以上抗原决定簇多价抗原。间接法：是测定抗体最常见方法。竞争法：可用于抗原和半抗原定量测定，也可反抗体进行测定。酶联免疫测定法第41页ELISA中有三个必要试剂：免疫吸附剂、结合物和酶底物。（1）已包被抗原或抗体固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标识抗原或抗体（结合物）；（3）酶底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；第四节ELISA技术关键点酶联免疫测定法第42页固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合酶标识物快速分离最常见方法

固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体表面

(1)固相载体酶联免疫测定法第43页要求

结合抗体或抗原容量大抗体或抗原牢靠地固定在其表面不影响免疫反应性利于反应充分进行固相方法简便易行，快速经济种类塑料制品

微颗粒膜载体

固相载体酶联免疫测定法第44页固相载体聚苯乙烯含有较强吸附蛋白质性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来免疫学活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。酶联免疫测定法第45页3.1.2包被方式

将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。

蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸附结合，靠是蛋白质分子结构上疏水基团与固相载体表面疏水基团间作用。酶联免疫测定法第46页包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原是抗原决定簇氨基酸序列人工合成多肽片段。普通只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但因为分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体吸附，间接地结合到固相载体表面。酶联免疫测定法第47页包被用抗体IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。酶联免疫测定法第48页封闭

封闭(blocking)是继包被之后用高浓度无关蛋白质溶液再包被过程。封闭就是让大量不相关蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后步骤中干扰物质再吸附.常见封闭剂：0.05%-0.5%BSA;10%小牛血清或1%明胶;

脱脂奶粉,比较价廉，能够高浓度使用（5%）。酶联免疫测定法第49页酶免疫技术关键组成个别

酶结合物（conjugate）酶标识物经过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物

（2）酶标识抗体或抗原结合物酶联免疫测定法第50页3.2结合物

即酶标识抗体（或抗原）是ELISA中关键试剂，对制备方法要求：

1酶催化活性（不影响）

2抗体（或抗原）免疫活性

3不含有或少含有游离抗体（或抗原）

4结合物尚要有良好稳定性。酶联免疫测定法第51页3.2.1结合物用抗原和抗体

制备结合物时所用纯度较高IgG，以免在与酶联结时其它杂蛋白干扰。最好用层析纯化抗体。抗体需要特异性好、效价高、亲协力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。在ELISA中用酶标抗原模式不多，总要求是抗原必须是高纯度。酶联免疫测定法第52页3.2.2酶纯度高，催化反应转化率高，专一性强，性质稳定，起源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同酶。酶结合物保留活性个别和催化能力，底物易于制备和保留，价格低廉，有色产物易于测定等。碱性磷酸酶，（AP），辣根过氧化物酶（HRP）另外还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰胆碱酯酶等等。其中以前两种（AP和HRP）最为常见。酶联免疫测定法第53页酶联免疫测定法第54页3.2.3结合物制备酶标识抗体制备方法主要有两种，（1）戊二醛交联法：（2）过碘酸氧化法(强氧化剂)：酶联免疫测定法第55页戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标识效率比一步法高，酶标识物质量较均一。

酶联免疫测定法第56页酶联免疫测定法第57页过碘酸氧化法酶联免疫测定法第58页纯化及判定标识完成后应除去反应液中游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，防止游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度

常见纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯酶标识抗体或抗原酶联免疫测定法第59页（三）酶标抗体判定

1．酶标抗体活性判定普通以琼脂扩散和免疫电泳进行判定。

2．酶结合物定量测定包含酶量、IgG含量、酶与IgG克分子比值以及结合率测定。

分光光度法P74酶联免疫测定法第60页标识酶要求：

活性高性质稳定专一性强酶催化底物显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶底物易于配制保留，酶及底物价廉

(3)酶和酶作用底物酶联免疫测定法第61页酶及其底物酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结产物。是ELISA成败关键试剂，它不但含有抗体抗原特异免疫反应，还含有酶促反应，显示出生物放大作用，但不一样酶选取不一样底物，将得到不一样颜色反应.酶联免疫测定法第62页酶底物显色反应

测定波长

辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

酶联免疫测定法第63页4对照设定

阳性对照品(positivecontrol)和阴性对照品(negativecontrol)是检验试验有效性控制品，同时也作为判断结果对照。 阳性对照品基础组成应尽可能与检测标本组成相一致

阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。酶联免疫测定法第64页二、反应条件选择酶标抗体浓度：包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法3.温度、时间等

酶联免疫测定法第65页酶联免疫测定法第66页酶联免疫测定法第67页10μg/ml

1:10001.170.150.09

1:50000.460.030

1:250000.1200

1μg/ml

1:1000＞20.250.10

1:50000.910.120.01

1:250000.250.010

0.1μg/ml

1:10000.420.130.13

1:50000.110.030.02

1:250000.0300

酶联免疫测定法第68页三、操作标准化

1加样

2保温

3洗涤

4比色酶联免疫测定法第69页加样:

在ELISA中普通有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔底部，防止加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。基础操作注意事项酶联免疫测定法第70页保温抗原抗体完成反应保温过程称为温育(incubation)。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体结合只在固相表面上发生。温育常采取温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是试验室中常见保温温度，也是大多数抗原抗体结合适当温度。酶联免疫测定法第71页洗涤洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着试验成败。ELSIA洗涤：到达分离游离和结合酶标识物目标。去除残留在板孔中游离物质，以及非特异性地吸附干扰物质。能够说在ELISA操作中，洗涤是最主要关键技术。洗涤方式除一些ELISA仪器配有特殊自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种酶联免疫测定法第72页显色显色是酶催化无色底物生成有