园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座

第九章园艺植物遗传转化载体构建园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第1页主要内容根癌农杆菌Ti质粒基因转载体构建发根农杆菌Ri质粒基因转化载体构建载体构建中惯用选择标识基因和汇报基因园艺植物惯用遗传转化载体类型目标基因与载体连接园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第2页

根癌农杆菌普通只侵染双子叶植物。农杆菌属（Agrobacterium）有2种主要植物病原菌根癌农杆菌（Agrobacterium

tumerfaciens)

携带有Ti质粒（Tumor-inducingplasmid）发根农杆菌（Agrobacterium

rhizogenesis）

携带有Ri质粒(Root-inducingplasmid)

在植物基因转化研究中，主要使用细菌质粒(大肠杆菌质粒，农杆菌质粒)和植物病毒作为载体。其中以根癌农杆菌Ti质粒转化载体是最为主要，是本章重点介绍内容。园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第3页冠瘿瘤病(根癌病)症状

1、植物根及茎基部产生

2、最初原因是受伤后引发

alfalfa根癌农杆菌（Agrobacterium

tumerfaciens）园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第4页发根农杆菌(Agrobacterium

rhizogenesis)园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第5页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建Ti质粒发觉历史1974年zeazen等从根癌农杆菌中分离出一巨大质粒，称为致癌质粒（Tumorinducingplasmid）,简称Ti质粒.最初发觉和命名是1907年,Smith和Townsent发觉双子叶植物常发生冠瘿瘤是由根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)诱发形成.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第6页Ti质粒遗传特征及类型

Ti质粒为染色体外遗传物质，为双股共价闭合环状DNA分子，其分子量为9.5×107～1.6×108，大小为180～250kb。迄今人们已从各种植物中分离出了不一样种类农杆菌，它们Ti质粒结构特征都有差异。依据Ti质粒诱导合成冠瘿碱(opine)种类不一样，Ti质粒可被分为四种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)、农杆菌素碱型(agrocinopine)或称琥珀碱型(succinamopine)。其中，章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒较为常见。园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第7页Ti质粒基因位点及其功效区域Ti质粒结构示意图（左）及乙酰丁香酮及其衍生物结构示意图（右）（1）T-DNA区（transferred-DNAregions）:T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上脱离下来转移并整合到植物核基因组上一段DNA。T-DNA片段上基因与肿瘤形成相关。（2）Vir区（virulenceregion）:该区段上基因产物为T-DNA转移及整合所必需，它造成农杆菌产生毒性，故称之为毒区。在Vir区有VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH7个操纵子共24个基因。（3）Con区（regionsencodingconjugations）:该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因（tra）,调控Ti质粒在农杆菌之间转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，故称为结合转移编码区。（4）Ori区（originofreplication）:该区段基因调控Ti质粒自我复制，故称为复制起始区（点）。LBRB园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第8页

Ti质粒介导基因转化原理1.植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质(如乙酰丁香酮、α-羟基乙酰丁香酮等)。2.酚类物质诱导Ti质粒上毒性基因(vir)表示:当根癌农杆菌接触到植物表面受伤部位后，这些酚类小分子化合物诱导信号经VIRA蛋白传递给VIRG，VIRG激活其它vir基因(virB、virC、virD、virE)表示Ti质粒上毒性基因(vir)表示。3.T-DNA单链分子释放：virD基因编码一个核酸内切酶，先在T-DNA右边缘区(RB)切开一个单链缺口，再在同一链左边缘区(LB)切开另一个单链缺口，使T-DNA以单链形式释放出来。4.T-DNA单链分子转移到寄主细胞：T-DNA单链分子与vir产物VIRD2蛋白共价结合，并在VIRD4和VIRB蛋白帮助引导下穿过根癌农杆菌内膜、外膜、细胞壁、以及植物细胞壁、细胞膜和核膜。园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第9页Ti质粒介导基因转化原理5.T-DNA整合到植物细胞染色体中。T-DNA单链分子进入植物细胞后，在植物相关酶体系催化下，互补双链T-DNA分子,在RB序列引导下，T-DNA分子整合到植物细胞染色体中。6.T-DNA区域中生长素和细胞分裂素基因过量表示造成细胞大量增值，形成冠瘿瘤，伴随转化细胞增值，T-DNA也被大量扩增，冠瘿碱合成基因拷贝也随之增加，这些基因表示后催化合成冠瘿碱，为农杆菌生长提供碳源和氮源。园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第10页信号受体（VIRA）酚类物质诱导信号VIRGRBLB转移到寄主细胞整合到植物染色体中T-DNA单链分子释放VIRG激活virB、virC、virD、virE、virH表示VIRD植物伤口诱导信号信号传递诱导表示VIRD2

、VIRD4

、VIRB、VIRE2等园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第11页土壤农杆菌与植物细胞相互作用可能性机制酚类物质VIRA

由此可见，农杆菌对植物侵染作用，就是一个天然发生基因工程。园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第12页一、Ti质粒改造(一)Ti质粒1.定义

是根癌农杆菌染色体外遗传物质,为双股共价闭合环状DNA大分子，其大小为180-240kb。2.种类2.1依据冠瘿碱种类不一样

章鱼碱型(octopine);胭脂碱型(nopaline);农杆碱型(agropine)和农杆菌素碱型(agrocinopine)or琥珀碱型(succinamopine)第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第13页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建(一)

Ti质粒2.种类2.2依据功效区段不一样

基因转移T-DNA区(transferredDNAregion)：

与基因转移相关

毒性区,即Vir区(Virulenceregion,Vir):激活T-DNA转移,使农杆菌对植物表现出侵染性毒性区

接合转移区(regionencodingconjuation,Con)调控Ti质粒在农杆菌间发生接合转移

自我复制区(originofreplication,Ori)调控Ti质粒自我复制园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第14页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建(二)天然Ti质粒存在缺点1.缺点

⑴野生型Ti质粒分子十分巨大；野生型Ti质粒分子普通都为180-240kb,几乎无法进行基因工程操作，所以应去除一切无须要大片段DNA。⑵限制性内切核酸酶位点众多；

Ti质粒是分布着各种限制性内切核酸酶，难以找到可利用单一限制性内切核酸酶位，所以极难经过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因.⑶T-DNA区段内含有许多编码基因；植物生长素合成酶基因,细胞分裂素合成相关酶基因等.⑷在大肠杆菌中不能复制。园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第15页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建(二)天然Ti质粒存在缺点2.改造⑴删除T-DNA左右边界中tms、tmr和tmt基因,即切除T-DNA中onc基因,构建所谓“卸甲载体”；⑵引入大肠杆菌复制起点和选择标识基因,或将Ti质粒T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒当中,形成植物基因转化载体系统,从而使经过Ti质粒基因重组成为可能并有利于转基因植物筛选；⑶插入人工多克隆位点，以利于外源基因克隆和操作；园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第16页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建⑷引入植物基因开启子和poly(A)信号序列，以确保外源基因在植物细胞内能正确高效地转录表示；⑸除去Ti质粒上其它非必需序列，以最大程度地缩短载体长度。研究表明,大肠杆菌含有能与农杆菌高效地接合转移特征,所以,能够先将T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒中,并插入外源基因,最终经过接合转移把外源基因引入到农杆菌Ti质粒上.

中间载体:

带有重组T-DNA大肠杆菌质粒衍生载体;

受体Ti质粒:接收中间载体Ti质粒.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第17页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建(三)御甲载体定义:无毒(non-oncogenic)Ti质粒载体,又称onc-载体。野生型Ti质粒中T-DNA中onc基因含有致瘤作用，所以,作为基因转化载体，必须切除T-DNA中onc基因，即解除其武装，构建成卸甲载体。在onc-卸甲载体中，已经缺失T-DNA部位通常被大肠杆菌中一个惯用质粒pBR322取代.这么任何适于克隆在pBR322质粒中外源DNA片段,都可经过pBR322质粒DNA与卸甲载体同源重组而被共整合到onc-Ti质粒载体上.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第18页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建二、Ti中间表示载体构建中间载体

定义:是指在一个普通大肠杆菌克隆载体中插入了一段适当T-DNA片段面组成小型质粒。中间载体从功效上可分为两大类:

1.克隆载体:复制和扩增基因2.表示载体:适于在受体细胞中表示外源基因载体Ti中间表示载体结构区包含:

选择标识基因区域;目标基因区域

每个区域由开启子、基因和终止序列组成.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第19页二、Ti中间表示载体构建(一)开启子及调控序列

经由Ti质粒将外源基因整合到植物中并不一定就会发生基因转录与表示，其先决条件在于必须要有适当开启子和调控序列。真核生物基因调控序列中，大多数都含有“TATA”框，位于距离转录起始点约30个核苷酸上游区域，上游DNA序列成份如“CAAT”(在上游-80～-70bp处)也普遍存在于许多真核生物基因开启子中。真核生物基因3端含有AATAAA序列，从而使基因在转录过程中能够在mRNA3端增加poly(A)信号。第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第20页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建由AATAAA编码mRNA序列AAUAAA作用是发出信号，让核酸酶在此序列下游10-15bp处切割mRNA,方便poly(A)聚合酶在切割点3‘端加上100-200个腺苷酸.其作用是使mRNA3端结合到内质网膜上,从而使3端稳定,起到保护mRNA作用.CaMV35S开启子Ubiquitin开启子园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第21页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建二、Ti中间表示载体构建(二)嵌合基因构建嵌合基因:来自两种或两种以上生物开启子,结构基因连接在一起而组成基因.完整嵌合基因:完整,正确可读框,能正确表示,3′端终止信号.“植物特异性开启子+目标基因+终止子”、“植物特异性开启子+选择标识基因+终止子”和“植物特异性开启子+汇报基因+终止子”，即是一个嵌合基因。园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第22页三、Ti共整合转化载体构建共整合载体定义指中间载体与改造后受体Ti质粒之间,经过同源重组所产生一个复合型载体.(一)Ti共整合载体特点①Ti共整合载体由两个质粒组成,其中一个是E.coli质粒中间载体,另一个是御甲Ti质粒组成.②农杆菌中两个质粒形成一个大共整合载体.③共合体形成频率与两个质粒重组频率相关,相对较低.④必须用Southern杂交或PCR对大共整合体质粒进行检测⑤构建是比较困难.第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第23页三、Ti共整合转化载体构建(二)Ti共整合转化载体类型和构建策略

基于中间载体与受体Ti质粒重组序列不一样,共整合载体可分为以pBR322序列为同源序列转化载体系统和基于左边界内部同源区(LIH)转化载体系统,即SEV系统.1.基于pBR322同源序列共整合载体构建策略这类载体系统经典特点是在卸甲质粒T-DNA区引入了pBR322,而中间载体是pBR322质粒或衍生质粒,二者之间经过同源重组实现目标基因及选择标识基因与卸甲Ti质粒整合,进而以顺式方式将基因转化到植物细胞中去.第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第24页1.基于pBR322同源序列共整合载体构建策略⑴中间载体导入农杆菌pBR322及由其衍生质粒为接合缺点型,所以它们进入到农杆菌菌株中必须要有帮助质粒,在帮助质粒动员下转移到农杆菌中.三亲杂交法:即将分别含有中间表示载体,帮助质粒,受体质粒菌液混合培养,在混合培养过程中,经过杂交使帮助质粒先转移到含有重组中间载体菌株中,然后中间载体再被动员和转移到农杆菌中.第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第25页1.基于pBR322同源序列共整合载体构建策略(2)中间载体与受体Ti质粒同源重组

pGV1103中间表示载体导入农杆菌后,因为两种质粒中都带有pBR322同源序列,所以少部分质粒发生重组和交换,使少数中间载体整合到pGV3850T-DNA区域内,形成一个大共整合载体.没有被整合中间表示载体因为不能在农杆菌中复制,它将会伴随农杆菌分裂增殖而自行消失.第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第26页园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第27页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建1.基于pBR322同源序列共整合载体构建策略(3)共整合载体选择经过pGV3850和pGV1103质粒同源重组形成共整合载体能够不停复制和增殖,整合在Ti质粒中中间载体随同Ti质粒得岂到复制和增值.中间载体所带有抗性基因(Ampr,Kanr,Smr或strr)都能得到表示.此时含有共整合质粒农杆菌将表现出中间载体携带抗性标识,从而在含有对应抗生素培养基上得到生长和筛选.未发生重组pGV3850,pGV1103等均不能生长.含有共整合质粒根癌农杆菌即可用于植物转化.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第28页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建1.基于pBR322同源序列共整合载体构建策略(3)共整合载体选择整合后Ti质粒含有重复pBR322序列,此重复序列在农杆菌转化植物细胞过程中,与目标基因及选择标识基因一起被整合到植物染色体组上.但这种重复序列有可造成基因深入重组及重排,从而影响外源基因表示.所以,在对pGV3850系统进行改进基础上,取得了pGV2260载体系统.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第29页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建1.基于pBR322同源序列共整合载体构建策略(3)共整合载体选择pGV2260系统:来自章鱼碱型Ti质粒pTiB6S3,整个T-DNA序列连同25bp末端序列均被一段pBR322所取代。与pGV3850区分在于pGV2260系统中间载体必须在外源基因两侧连接25bp末端序列.共整合发生后,pGV2260系统中pBR322重复序列在25bp末端序列以外,不会随T-DNA一起整合到植物染色体中.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第30页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建2.SEV系统构建1985年美国孟山都企业Fraley等建立了另一个共整合载体,即拼接末端载体(split-endvector,SEV)系统即T-DNA边界拼接系统,也因为它两个“左边界内部同源区”(leftinsidehomology,LIH)序列在同源重组前分别处于不一样质粒上而得名.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第31页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建2.SEV系统构建构建过程:(1)SEV受体Ti质粒是pTiB6S3-SE,来自野生型质粒pTiB6S3突变体.它TL-DNA上致瘤基因(onc)及TR都缺失,T-DNA保留部分被称为LIH,即左边界内部同源序列.该受体Ti质粒还保留了Vir基因及其它正常功效基因,同时还携有用于细菌筛选卡那霉素抗性基因(Kanr).园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第32页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建(2)SEV中间载体是pMON200.

它含有一个胭脂碱合成酶基因,一个在细菌里编码壮观霉素抗性基因(Sper),链霉素抗性基因(Strr)及在植物中作选择标识基因新霉素磷酸转移酶基因(NptⅡ).另外,它还含有一个多克隆位点(MCS),能够方便地插入外源基因.更为主要是它含有与受体Ti质粒同源LIH序列及TR.从pMON200衍生出一个新质粒pCIT30含有更理想特征.质粒pCIT30中,潮霉素抗性基因(Hygr)代替了MMiI基因,而且引入了一个cos位点和多克隆位点.在噬菌体包装系统中可在cos位点上插入25-40kb植物DNA,不需要额外亚克隆步骤.多克隆位点上含有克隆和释放插入DNA所需要限制酶酶切位点。该载体还含有T7和S6细菌噬菌体开启子，它们用于转录染色体步移中末端特异性RNA探针.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第33页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建(3)经过三亲杂交将中间载体pMON200或pCIT30导入农杆菌后,因为它之间都含有LIH同源序列,即可发生同源重组,形成SEV共整合载体.SEV包含有分别来自两个质粒左右边界及Vir基因,成为一个完整非致瘤性Ti质粒.因为中间载体带有抗性嵌合基因,因而转化植物能够直接进行筛选.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第34页园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第35页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建(3)SEV系统与pGV3850系统比较相同点:二者都是经过受全Ti质粒与中间载体同源重组而形成,故同属于共整合载体.不一样点:

①它们受体Ti质粒与中间载体结构不一样.pGV3850左右边界(TL,TR)在一个受体Ti质粒上,而SEV来自两个质粒,即TR来自中间载体.②同源序列不一样.

pGV3850重组同源序列是pBR322,而SEV是LIH.③SEV是更有效共整合载体.pGV3850共整合载体转化植物中也带有重复pBR322序列.此重得序列可能对转化植物中外源基因稳定性有影响,而SEV系则排除了这种可能,所以更为有效.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第36页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建四、Ti双元转化载体构建双元载体(binaryvector)定义:是指由两个分别含T-DNA和Vir区相容性突变Ti质粒组成双质粒系统.因为T-DNA与Vir基因分别位于两个独立质粒上,Vir基因是经过反式激活方式促成T-DNA转移,故称为反式载体.通常含有T-DNA序列穿梭载体用于携带嵌合基因,而含Vir基因Ti质粒作为辅助质粒激活T-DNA转移。园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第37页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建(一)

Ti双元转化载体系统构建原理Ti质粒上vir基因与T-DNA含有反式互补作用,即Vir基因能够反式激活T－DNA转移。依据这一原理能够使T-DNA与Vir区处于不一样复制子或不一样Ti质粒上,一样能够激活T-DNA转移,使插入到T-DNA区外源基因导入植物细胞中;双元载体含有广泛寄主范围质粒复制起始点(ori),从而代替了在共整合载体中用以重组同源区.它能够在任何农杆菌寄主里自发复制,这意味着全部农杆菌菌株不论带有Ti质粒还是Ri质粒,不论它是武装，还是解除武装，都能导入中间表示载体而成为双元表示载体，寄主仅需要提供一套完整Vir基因.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第38页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建(二)Ti双元转化载体系统特点由两个彼此相容Ti质粒组成：1.转移载体质粒

是T-DNA缺失突变型质粒,类似于共整合表示系统中卸甲质粒。2.穿梭质粒园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第39页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建穿梭质粒特点：(1)含有PK2质粒复制功效，能够在大肠杆菌和根癌农杆菌中复制，而且与Ti质粒是相容;(2)含有Ti质粒左右两侧或右侧边缘区序列，使DNA能够转移到植物细胞；(3)边缘区序列内包含植物选择标识嵌合基因，用于转基因阳性株初步筛选；(4)带有抗生素基因,普通是Kanr基因,能够作为细菌转化子选择记号园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第40页第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体构建(三)共整合载体系统与双元表示载体系统比较

两个系统在构建思绪上,一个是应用了Vir基因对T-DNA顺式作用,一个是应用了反式调控,二者之间存在较大差异.(1)双元表示载体构建简单;双元表示载体含有双复制位点;双元表示载体接合频率更高;双元表示载体在判定上更为轻易;双元表示载体稳定性不如共整合载体.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第41页第二节发根农杆菌Ri质粒基因转化载体构建发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)与根癌农杆菌(A.tumefaciens)同属，但发根农杆菌侵染植物细胞后，会被其Ri质粒诱导产生类似于不定根毛发状物。发根农杆菌侵染植物后,会诱使植物细胞产生许多不定根，这种不定根生长快速，不停分支成毛状，故称毛状根，也称发状根，而Ri质粒为根诱导质粒.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第42页第二节发根农杆菌Ri质粒基因转化载体构建与根癌农杆菌Ti质粒相比,Ri质粒转化含有许多优点：①能够不经解除武装进行转化，而且转化产生发状根能够再生；②发状根是一个单细胞克隆，可发防止产生嵌合体；③可直接作中间载体；④发状根适于进行离体培养，而且很多植物发状根在离体培养条件下都表现出原植株次生代谢产物合成能力。所以，Ri质粒不但可作为转化优良载体，而能应用于有价值次生代谢物生产。园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第43页第二节发根农杆菌Ri质粒基因转化载体构建一、Ri质粒基因结构Ri质粒与Ti质粒一样属于巨大质粒,Ri质粒大小为200-800kb,而且在一个菌株之间可能存在着各种质粒.Ri质粒也可划分为T区,Vir区,ori区和其它区域等.Ri质粒分类:Ri质粒转化植物细胞可合成一类特殊氨基酸衍生物——冠瘿碱，这些冠瘿碱合成酶基因位于T—DNA上．在真核细胞中因为存在有活性冠瘿碱基目标开启子，所以．这些冠瘿碱基因可在真核细胞中表示。当前，已在Ri质粒转化植物细胞中发觉了各种类型冠瘿碱：农杆碱、甘露碱、黄m碱和农杆碱酸、甘露碱酸、农杆碱素A～D，依据合成冠瘿碱种类不一样，可将Ri质粒分成农杆碱型、甘露碱型和黄瓜碱型。园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第44页第二节发根农杆菌Ri质粒基因转化载体构建Ri质粒上与转化相关区域有Vir区(致病区)和T区(转移区)。Vir区距T—DNA35kb，长约20kb在T—DNA转移过程中．Vir区基因并不转移，但该区域缺失或突变将造成致病能力减弱或丧失，使被感染植株不出现含有主要作用。经过对Vir区核昔酸序列分析表明．3种类型Ri磺粒Vir区含有很高保守性．而且与Ti质粒Vir区同源农杆碱型质粒T区可分为T区和T区，对应DNA分别称之为T一DNA和TDNA。T区与T区是间断．两区之间是大约15kb非转移DNA甘露碱型Ri质粒和黄瓜碱型鼬质粒T区则都只有一段单一长约20kb连续TDNA3种Ri质粒TDNA两端各有一段与Ti质粒T—DNA左右边界序列含有很强同源性25bp重复序列.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第45页第二节发根农杆菌Ri质粒基因转化载体构建二、Ri中间表示载体构建Ri质粒T-DNA上基因只是诱导植物产生不定根,并不影响植株再生,所以,野生Ri质粒能够直接作为转化载体,也就是说不需要“卸甲”过程。Ri转化系统中间载体构建与Ti转化中间表示载体构建相同.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第46页第二节发根农杆菌Ri质粒基因转化载体构建三、Ri共整合转化载体构建在Ri共整合转化载体构建过程中,中间载体惯用Pbr322,pBI21及Pcam-BIA系列等.把目标基因插入到T-DNA中，组成中间表示载体。然后经过诱导菌株帮助质粒和野生型发根农杆菌直接进行三亲杂交，经过同源重组把中间载体整合到Ri质粒T-DNA中,即构建成带有目标基因共整合载体,它和Ti质粒共整合载体唯一不一样之处是可直接利用野生型Ri质粒.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第47页第二节发根农杆菌Ri质粒基因转化载体构建四、Ri双元转化载体构建Ri质粒双元载体转化策略及其构建程序基本和Ti质粒相同.原理主要是Ri质粒Vir基因在反式条件下一样能驱动T-DNA转移，即Vir基因和T-DNA分别在两个Ri质粒上一样能执行上述功效.园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第48页第三节载体构建中惯用选择标识基因和汇报基因怎样选择和筛选转化体，一样是一个主要问题。科学家们一直试图在转化体带上一个标识，从而便于选择和筛选。

选择标识基因和筛选标识基因（又称汇报基因）在功效和性质上有一定差异。

选择标识基因是：该基因产物赋予植物细胞某种抵抗选择压力能力，使转化细胞能够正常生长发育，未转化细胞则不能甚至死亡，从而将转化细胞选择出来。筛选标识基因则强调给转化细胞带上一个标识，起汇报或识别作用，故也称为汇报基因(如GUS基因、GFP基因）。园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第49页

作为一个标识基因(不论是选择标识基因还是筛选标记基因)，都必须具备以下四个条件：①编码一个不存在于正常植物细胞中酶；②基因较小，可组成嵌合基因；③能在转化细胞中充分表示；④检测轻易，并能定量分析。下面对一些惯用选择基因或汇报基因进行介绍：

园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第50页（一）选择（标识）基因

1、新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）

nptⅡ基因又称氨基葡萄糖苷磷酸转移酶基因，最初是从细菌转座子Tn5中分离得到，其表示产物氨基葡萄糖苷磷酸转移酶经过磷酸化使抗生素失活，从而解除抗生素毒性。

nptⅡ基因是当前植物遗传转化中应用最广泛选择标识基因，其适用抗生素种类为卡那霉素、庆大霉素和G418等。未转化草莓外植体

转化草莓外植体

园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第51页2、潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）潮霉素对许各种植物都会产生很强毒性。细菌中存在潮霉素磷酸转移酶基因产物—潮霉素磷酸转移酶可经过酶促磷酸化作用使潮霉素失活，从而产生对潮霉素抗性。对一些用卡那霉素不能进行有效选择植物（如拟南芥），经过导入该基因并使用潮霉素作选择剂，效果相当显著。园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第52页3、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）将cat基因作为选择标识基因导入植物后，转化细胞得到抗氯霉素特征。4、其它选择标识除上述选择标识外，还有许多项选择择标识基因可供利用，尤其是抗除草剂基因(非抗生素素基因)，在研究中使用逐步增多。园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第53页（二）汇报基因

汇报基因（reportergene）通常是指在转化系统中经过其表达来确定是否转化成功一类基因，它起到汇报（而非选择）作用，故称为汇报基因。理论上讲，经过选择培养后存活细胞及其再生植株均应是转基因，但实际上，因为种种原因，其中仍可能大量存在着嵌合体、假转化体和自发突变产生抗性突变体。所以，对经过选择后细胞仍要深入筛选，确定其为真正转基因个体。理想汇报基因应该具备以下条件：其产物在原植物中不存在或本底很低，而且对宿主植物细胞无毒性；表示产物应有适度稳定性以利于检测；检测方法应简单、灵敏并能够进行定量。惯用报告基因以下：园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第54页1、β-葡萄糖酸酶基因（gus）

gus基因是广泛应用汇报基因，它在植物细胞中产生葡萄糖苷酸酶，在一定条件下催化X-Glucuionicacid(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯)底物，产生蓝色沉淀；另外，另一个底物4-MUG（4-甲基-伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸酯）在GUS作用下形成4-MU（4-甲基伞形花酮），后者在365nm光下激发产生荧光，可用荧光光谱法检测。这种方法检测轻易，成本低廉，故被广泛使用。惯用汇报基因β-葡萄糖酸酶基因（gus）绿色荧光蛋白基因（gfp）冠瘿碱（opine）合成酶基因花青素合成相关基因园艺植物遗传转化载体的构建课件专家讲座第55页转基因烟草植株GUS组织化学染色结果A-D，pAAP2:GUS、p35S-AAP2:GUS和p35S:GUS转基因烟草植株根、茎、叶和花GUS组织化学染色结果。E，在萌发T1幼苗中也观察到了相同GUS染色结果。WT，野生型对照烟草植株；AAP2，转化pAAP2:GUS载体转基因烟草植株；35S-AAP2，转化p35S-AAP2:GUS载体转基因烟草植株；35S，转化p35S:G