糖基转移酶和糖苷酶

糖基转移酶和糖苷酶第1页，共111页，2023年，2月20日，星期日第一节糖基转移酶(Glycosyltransferases)糖基转移酶是一系列参与催化双糖、聚糖和糖复合物中糖链合成的一类酶。负责将活性供体(通常是NDP-糖)的单糖转移到糖、蛋白质、脂类、核酸分子上，完成糖基化反应。目前发现的糖基转移酶有100多种，其主要分布在内质网和高尔基体。第2页，共111页，2023年，2月20日，星期日第3页，共111页，2023年，2月20日，星期日第4页，共111页，2023年，2月20日，星期日一、糖基转移酶的命名与分类糖基转移酶的传统分类方法是根据其所转移的单糖类型进行分类的。如半乳糖转移酶，唾液酸转移酶等。另外一种方法是根据序列的同源性、底物/产物立体化学异构性以及供体糖进行分类。这种分类法糖基转移酶被分为66个家族及一个未分类族。所有家族只采用两种折叠方式，形成了两个超家族，分别为GT-A和GT-B超家族。第5页，共111页，2023年，2月20日，星期日

糖基转移酶的命名GlcNAcT-I的全称为：UDP-N-乙酰葡糖胺:-3-甘露糖基-1,2N-乙酰葡糖胺转移酶。GlcNAcT-II的全称为：UDP-N-乙酰葡糖胺:-6-甘露糖基-1,2N-乙酰葡糖胺转移酶。第6页，共111页，2023年，2月20日，星期日

-1,4-GalactosyltransferaseFamily第7页，共111页，2023年，2月20日，星期日

FucosyltransferaseFamily

第8页，共111页，2023年，2月20日，星期日

Allmembersofthesialyltransferasegenescloned第9页，共111页，2023年，2月20日，星期日TheEvolutionaryHistoryofGlycosyltransferaseGenes后生动物后口动物脊椎动物哺乳动物原始昆虫无脊椎动物非哺乳动物第10页，共111页，2023年，2月20日，星期日二、糖基转移酶特性一个基因一种转移酶

一种连接键糖链的合成不是由基因编码合成的，而是由基因编码的糖基转移酶通过糖基化作用，将糖基由其供体转移到受体上完成的。每个糖基转移酶都有自己特异供体、受体和联接键，这就保证了在没有模板的情况下合成特异性的糖。糖链可以认为是基因的次级产物,一个基因编码一个糖基转移酶,一个糖基转移酶专一地催化一个糖苷键的合成，一条糖链的合成就需要一个多酶系统,也就对应了一个基因组。第11页，共111页，2023年，2月20日，星期日糖基转移酶特性糖基转移酶绝大部分是II型膜结合蛋白，即较短的N-端在胞浆，有一穿膜部分通过内质网或高尔基体膜，长的C-端在内质网或高尔基体的管腔内。有少数糖基转移酶是I型膜结合蛋白，其较短的N-端在内质网腔，而很长的C-端则定位于胞浆。第12页，共111页，2023年，2月20日，星期日BiologicalFunctionsofaSolubleFormofN-acetylglucosaminyltransferaseV(GnT-V)

第13页，共111页，2023年，2月20日，星期日RegulationofHighBranchinginN-linkedOligosaccharides第14页，共111页，2023年，2月20日，星期日第15页，共111页，2023年，2月20日，星期日大鼠不同组织中三种Ｎ-乙酰葡糖胺基转移酶(GlcNAcT)组织活力(pmol／mg蛋白·h)GlcNAcT-IIGlcNAcT-IVGlcNAcT-V肾18403301.91.6306脑660488.70.7381胃5001508.20.7251小肠28099171.56811肺1044.62.60.7384脾1002.5208212睾丸522.98.20.8374心111.19.41.4101肝810.92.80.78.20.8第16页，共111页，2023年，2月20日，星期日

三、糖基转移酶的结构域属于II-型膜结合蛋白的糖基转移酶分成四个结构域。氨基端的胞浆域，一般少于25个(最少4个)氨基酸，含正电荷的碱基氨基酸较多；穿膜域，有少量氨基酸残基，富含疏水氨基酸；颈区域，位于内质网或高尔基体管腔内，含甘氨酸和脯氨酸残基，有的带有N-糖链。第17页，共111页，2023年，2月20日，星期日

糖基转移酶的结构域催化域，为管腔中的最大结构域，呈球状，约含310-430个(最长可达720个左右)氨基酸残基，为糖基转移酶最重要的催化区域。第18页，共111页，2023年，2月20日，星期日克隆的哺乳动物糖基转移酶的结构域第19页，共111页，2023年，2月20日，星期日

四、糖基转移酶的催化特性与功能(1)底物专一性糖复合物中糖基的顺序和连接键是由糖基转移酶的底物专一性和催化特性来决定的。对底物专一性，一个酶的产物常作为下一个酶的底物，这样就保证了糖链中糖基的特定顺序。因合成的产物结构不同或合成的部位不同，所用的供体和受体也不同。第20页，共111页，2023年，2月20日，星期日

糖基转移酶的催化特性合成糖原时，葡萄糖的供体是UDP-Glc，合成淀粉时，则是ADP-Glc，合成纤维素时是GDP-Glc。对受体的专一性，在糖蛋白的N-糖苷键连接的糖链的外周有6种不同的方式连接的N-乙酰葡糖胺(GIcNAc),它们连接在不同甘露糖基(Man)的不同糖基上，分别有6个不同的糖基转移酶负责它们的转移，每个酶又对应不同的受体。第21页，共111页，2023年，2月20日，星期日不同的糖基转移酶所催化的糖基转移反应不同第22页，共111页，2023年，2月20日，星期日人B血型的1-3半乳糖基转移酶对受体底物的专一性第23页，共111页，2023年，2月20日，星期日

糖基转移酶的催化特性唾液酸化LewisX四糖抗原合成时，一般先生成唾液酸化的N-乙酰乳糖胺，再由-1,3FucT在G1cNAc上加入Fuc，而不能先合成岩藻糖化的N-乙酰乳糖胺后再加上NeuAc。因-2,3NeuAc

T不能以-1,3岩藻糖化糖链为底物。第24页，共111页，2023年，2月20日，星期日

糖基转移酶的催化特性糖基转移酶也可作用于人工底物，如参与糖蛋白糖链合成的糖基转移酶也可利已除去蛋白质而还原末端标记(荧光和放射性核素)的底物。不少糖基转移酶对底物的识别实际上只涉及受体底物中接受糖基邻近的少数糖基，故一些人工合成的寡糖衍生物也可作为这些酶的底物。第25页，共111页，2023年，2月20日，星期日

糖基转移酶的催化特性(2)二价金属离子的需求大多数的糖基转移酶都需二价金属离子作为辅助因子，缺乏二价金属离子时(如在EDTA存在下)酶活力很低或丧失。二价金属离子中Mn2+的激活作用最强，其次是Co2+,Mg2+,Ni2+。糖基转移酶T-V不需要二价金属离子。第26页，共111页，2023年，2月20日，星期日

五、糖基转移酶同源性和抗原性糖基转移酶在结构上的最大特点是不同糖基转移酶一级结构之间的同源性很少，即使转移相同糖基的糖基转移酶也很少有同源性。血型A抗原的GalNAc

T和血型B抗原的GalT同源性达99％，在353个氨基酸残基中只有4个不同。第27页，共111页，2023年，2月20日，星期日

糖基转移酶同源性和抗原性不同种属中同一糖基转移酶的同源性极大，其催化结构域的同源性一般均在80％以上。如人、小鼠和兔中-1,2GlcNAcT-I四个结构域的同源性分别为100%、90%、80%和95%。第28页，共111页，2023年，2月20日，星期日六、糖基转移酶和疾病-1,3T的活性在人体内的重现会引发自身免疫反应。相反，如果人体内-1,4半乳糖基转移酶的活性下降，致使正常的免疫球蛋白G(IgG)分子中的糖链半乳糖含量降低。它能诱导抗体产生，从而也会出现自身免疫，其症状是类风湿。第29页，共111页，2023年，2月20日，星期日糖基转移酶和疾病细胞癌变过程中常伴有糖链结构改变，如糖链分支末端出现重复N-乙酰半乳糖胺结构、唾液酸和岩藻糖含量增加，这些变化在临床上常用作肿瘤标记物。糖基转移酶就是通过影响糖链的改变，而间接关系到癌瘤发生和发展。第30页，共111页，2023年，2月20日，星期日糖基转移酶和疾病糖基转移酶的表达和细胞周期密切相关。在细胞分化阶段，如果糖基转移酶在成熟细胞中活性很高，就会产生癌变，同时出现早期的分化抗原。多聚N-乙酰半乳糖胺链的出现被看成是肿瘤的重要标志。这些糖链可以减低细胞与基质间的粘着，有利于癌细胞的进一步侵入。第31页，共111页，2023年，2月20日，星期日糖基转移酶和疾病与肝癌发生有关的糖基转移酶糖基转移酶在肝癌中活性有明显改变，如GnT-Ⅳ、GnT-Ⅴ和-1,6岩藻糖基转移酶。GnT-Ⅳ和GnT-Ⅴ能将一个N-乙酰葡糖胺转移至N-糖链五糖核心1,3和1,6臂甘露糖上,分别形成-1,4和1,6键，使N-糖链天线数增多，-1,6FucT则将岩藻糖转移至糖链最内侧(与天冬酰胺相邻)的N-乙酰葡糖胺上形成核心岩藻糖。第32页，共111页，2023年，2月20日，星期日糖基转移酶和疾病这些结构异常的糖链出现在肿瘤细胞的糖蛋白上，使肿瘤细胞表面性质变化，导致细胞粘附、侵袭和迁移能力改变，是造成肿瘤细胞具有侵袭性和转移能力的一个重要原因。第33页，共111页，2023年，2月20日，星期日七、糖基转移酶的应用糖基转移酶在肝癌研究中的应用恶性肿瘤中糖基转移酶表达及活性改变所致肿瘤细胞表面糖链结构的变化在肿瘤的诊断、预防方面有重要意义。将糖基转移酶基因转染入肝癌细胞，过表达的糖基转移酶使细胞内某些蛋白发生糖基化,产生不同糖型，通过双向电泳和凝集素免疫印迹相结合，比较转染组和非转染组糖蛋白改变，从而确定蛋白质和糖基化的功能关系,研究为糖基化改变在肝癌发生中的作用研究奠定了基础。第34页，共111页，2023年，2月20日，星期日糖基转移酶的应用采用同样技术路线研究与乳腺癌转移相关的糖基化改变，并从结构上描述糖链，旨在将其作为乳腺癌和其他实体肿瘤诊断工具和免疫治疗靶点。第35页，共111页，2023年，2月20日，星期日糖基转移酶在糖类合成中的应用糖类药物在治疗炎症、用作肿瘤疫苗和抗病毒等方面都有其独特的功效。现在普遍使用的糖类合成方法有两种：化学合成和酶促合成化学合成近年来取得一些进展，提出了一种全自动寡糖合成法，但在天然复合产物中以一种糖代替另一种糖仍然困难。酶促合成的产量高、产物具有特异立体化学异构性。糖基转移酶的应用第36页，共111页，2023年，2月20日，星期日糖基转移酶的应用糖基转移酶可作为研究糖复合物工具如研究糖蛋白糖链的结构与功能的关系以及细胞表面糖基化修饰等。第37页，共111页，2023年，2月20日，星期日八、O-GlcNAc

糖基转移酶在原核和真核细胞中的表达和提纯南通医学院生物化学教研室与美国纽约州立基础研究所神经生化系合作。O-GlcNAc糖基化修饰起到调节蛋白质的活性，在生命过程的许多方面起作用(如核运输，基因转录及翻译过程)。OGT基因敲除实验表明蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰是胚胎干细胞存活和个体发育所必需的。蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰还调节蛋白质磷酸化，蛋白质的O-GlcNAc糖基化与磷酸化修饰间存在相互竞争、相互补充的关系。第38页，共111页，2023年，2月20日，星期日细胞质和细胞核内的蛋白质O-GlcNAc糖基化和去糖基化分别由O-GlcNAc糖基转移酶(OGT)和O-GlcNAc糖苷酶催化。蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰及其生物学意义目前成了蛋白质翻译后修饰领域最热门的课题之一。其研究目的：用原核和真核细胞表达OGT，并用不同的方法从这两个系统提纯重组OGT，获得制备有活性的OGT，用于进行O-GlcNAc糖基酶功能方面的研究。第39页，共111页，2023年，2月20日，星期日研究结果用大肠杆菌和Hi5昆虫细胞表达并纯化具有活性的重组OGT。携带人OGTcDNA的PET32a质粒在大肠杆菌中表达出带有1个S-Tag的重组人OGT融合蛋白，然后用与S-蛋白质偶联的琼脂糖凝胶颗粒从细菌裂解液中亲和层析纯化得到OGT融合蛋白。其纯化的OGT在电泳中显现单一条带并具有生物活性，但其活性在洗脱后丧失。第40页，共111页，2023年，2月20日，星期日IPTG诱导重组OGT在BL21大肠杆菌中的表达第41页，共111页，2023年，2月20日，星期日大肠杆菌中表达的重组OGT经S-蛋白质凝胶纯化第42页，共111页，2023年，2月20日，星期日研究结果在Hi5昆虫细胞中表达的鼠肝OGT，经镍离子螯合柱纯化后,其比活性达到0.88nmol·min-1·mg-1OGT。Hi5细胞中表达的重组OGT的纯化第43页，共111页，2023年，2月20日，星期日甜菊糖基转移酶基因的克隆及序列分析利用与植物次生代谢产物糖基化相关的UDPG糖基转移酶的特征性保守区域，设计了同源引物。以甜菊基因组DNA为模板，PCR扩增获得甜菊糖基转移酶基因片段。根据获得的基因片段设计引物GSTr和GSTf，分别与cDNA文库的T3和T7通用引物扩增获得全长核苷酸序列的甜菊糖基转移酶基因。第44页，共111页，2023年，2月20日，星期日第45页，共111页，2023年，2月20日，星期日Thelevelofexpressionofplantglycosyltransferases第46页，共111页，2023年，2月20日，星期日TransgenicpigswithGnT-III第47页，共111页，2023年，2月20日，星期日Recombinantplantglycosyltransferasesreportedrecently(2001–2004)第48页，共111页，2023年，2月20日，星期日葡糖基转移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的实验研究葡糖基转移酶是致龋菌的重要致病因素之一，具有利用蔗糖合成细胞外葡聚糖的催化活性和结合葡聚糖的活性，在细菌附着和菌斑形成的过程中起着重要作用。抑制GTF活性，减少葡聚糖的产生是控制菌震斑预防龋病的重要手段之一。目的：动物体内研究葡糖基转移酶多肽疫苗HDS

免疫原性和防龋效果。第49页，共111页，2023年，2月20日，星期日葡糖基转移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的实验研究方法：构建大鼠人工龋模型，分别用人工抗原HDS-KLH，多肽抗原HDS，葡糖基转移酶(GTF)免疫大鼠，酶联免疫吸附法检测大鼠血清和唾液中抗HDS、GTF抗体；体视显微镜下观察各组大鼠磨牙龋坏情况，并用Keyes计分法计分。第50页，共111页，2023年，2月20日，星期日葡糖基转移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的实验研究结果：HDS-KLH免疫组大鼠唾液、血清中抗HDSIgG和IgA水平均高于对照组(P<0.05)；HDS-KLH，HDS，GTF免疫组大鼠龋Keyes计分均低于对照组(P<0101)，光滑面防龋效果最为显著。结论：人工抗原HDS-KLH能刺激机体产生针对GTF的保护性免疫，并减少实验大鼠龋齿发生。第51页，共111页，2023年，2月20日，星期日葡糖基转移酶抗体的制备与研究以葡糖基转移酶免疫产蛋母鸡。应用酶联免疫吸附测定法测定鸡蛋黄中免疫球蛋白的活性。经葡糖基转移酶免疫后可以得到高效价的蛋黄抗体，其抗远援链球菌的效价约为一般IgY的16倍。体外模拟实验表明经远援链球菌免疫的蛋黄抗体确实有抗牙菌斑形成的能力，从而具备防龋齿的功效。第52页，共111页，2023年，2月20日，星期日第二节糖苷酶糖苷酶(G1ycosidase)是一大类催化糖苷键水解的酶类。其主要分布在动物、植物、微生物体内，担负着水解各种糖苷、寡糖、多糖、复杂多糖以供机体利用的生物学功能。大多数糖苷酶水解典型O-糖苷键，也有部分水解N-糖苷键，有一些糖苷酶水解S-糖苷键。第53页，共111页，2023年，2月20日，星期日一、糖苷酶的分类按照酶的作用方式和水解产物可把糖苷酶分为两大类：外切糖苷酶类（Exoglycosidases)：它们的作用方式是从糖链的非还原端开始，逐步将糖苷键切断，所得到的水解产物为单糖或双糖；内切糖苷酶类（Endoglycosidases)：它们从糖链的中间打断糖苷键，水解产物为分子量小于原来底物的寡糖。第54页，共111页，2023年，2月20日，星期日Exo-1-4-Beta-D-Glycanase第55页，共111页，2023年，2月20日，星期日第56页，共111页，2023年，2月20日，星期日二、糖苷酶的分布糖苷酶在自然界有广泛分布，几乎所有动物、植物和微生物体内都能找到糖苷键。在哺乳动物中，血清、血细胞、体液、各种组织器官中都有存在。许多软体动物也是糖苷酶的良好来源。植物种子里有丰富的糖苷酶。一些细菌、酵母、霉菌的糖苷酶已有相当的研究报道。第57页，共111页，2023年，2月20日，星期日三、糖苷酶的命名糖苷酶的命名与它的底物专一性密切相关。底物专一性包含：糖基一侧的专一性；糖苷键的--异头专一性；糖苷配基一侧的专一性。糖苷酶的命名是根据糖基一侧的专一性和糖苷键的--异头专一性来命名的。-葡萄糖苷酶、-葡萄糖苷酶、-半乳糖苷酶、-甘露糖苷酶等。第58页，共111页，2023年，2月20日，星期日(1)糖基一侧的专一性(2)糖苷键的--异头专一性(3)糖基配基一侧的专一性第59页，共111页，2023年，2月20日，星期日四、糖苷酶的生物学功能(1)分泌到细胞外的糖苷酶，参与营养物质的胞外消化吸收过程。(2)细胞内的糖苷酶，如动物细胞内的溶酶体中有一系列糖苷酶，它们的功能是降解胞内的糖复合物。(3)参与糖链的合成，如在糖蛋白生物合成过程中，参加N-型糖链的“剪枝”，“修剪”成较短分支(Man3GlcNAc-Asn)结构，然后再由糖基转移酶加上新的糖基，形成不同结构的糖链。第60页，共111页，2023年，2月20日，星期日第61页，共111页，2023年，2月20日，星期日第62页，共111页，2023年，2月20日，星期日第63页，共111页，2023年，2月20日，星期日BiologicalRolesofN-glycanaseinCells第64页，共111页，2023年，2月20日，星期日第65页，共111页，2023年，2月20日，星期日第66页，共111页，2023年，2月20日，星期日五、一些常见的糖苷酶-D-甘露糖苷酶-D-甘露糖苷酶-D-木糖苷酶,-鼠李糖苷酶-D-葡萄糖苷酶-D-葡萄糖苷酶：海藻糖酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡聚糖蔗糖酶、淀粉麦芽糖酶。

唾液酸酶(神经氨酸酶类)。第67页，共111页，2023年，2月20日，星期日一些常见的糖苷酶-D-半乳糖苷酶-D-半乳糖苷酶-D-N-乙酰半乳糖胺酶-D-N-乙酰己糖胺酶-D-N-乙酰葡糖胺酶-D-N-乙酰半乳糖胺酶-D-岩澡塘苷酶-L-岩澡塘苷酶第68页，共111页，2023年，2月20日，星期日水解不同类型糖苷键的糖苷酶第69页，共111页，2023年，2月20日，星期日六、糖苷酶的制备方法黄芪皂苷糖苷酶产生菌的筛选将筛选用菌株Absidasp.A9r、A84r、A9r、A8r、A38r、Arr进行培养制备酶液

以黄芪总皂苷为底物进行诱导薄层层析法检测水解结果。结果：Absidasp.A3r菌所产酶液能较好的水解黄芪总皂苷中糖基较多的皂苷，进而生成糖基较少的皂苷。第70页，共111页，2023年，2月20日，星期日绿色木霉产生的外切β-葡聚糖苷酶从潮湿的树皮及腐烂的木块上采集样本加适量的无菌水温和搅拌取1ml悬浊液,分别涂于含有滤纸的固体筛选培养基上待长出若干菌落后，对生长良好的菌种进行分离以羧甲基纤维素钠为底物分别测定其所产酶活性。菌培养液过滤上清液硫酸铵沉淀

Sephadex柱层析DEAE2纤维素52阴离子交换柱层析收集洗脱纯酶液。第71页，共111页，2023年，2月20日，星期日一株神经节苷脂内切糖苷酶产生菌的分离采用神经节苷脂选择性培养基，从土壤微生物中筛选得到一株产神经节苷脂内切糖苷酶的菌株YW2112，该酶能特异性水解神经节苷脂中连接神经酰胺和寡糖链之间的糖苷键，是研究神经节苷脂结构与功能的重要工具酶。第72页，共111页，2023年，2月20日，星期日人参糖苷酶提取目的：用于对人参皂苷进行改造的糖苷酶。方法：从鲜人参根中提取人参皂苷酶，乙醇沉淀，离子交换层析纯化，凝胶电泳分析，薄层色谱法测酶活力。结果：经离子交换层析得到人参皂苷-葡糖苷酶。第73页，共111页，2023年，2月20日，星期日七、糖苷酶的分离、纯化和测定糖苷酶的分离纯化，在原则和技术方法上和一般的蛋白质或酶的分离纯化没有区别。常用的方法：盐析(硫酸铵沉淀)、柱层析(离子交换、凝胶过滤、亲和层析、吸附)，电泳等。第74页，共111页，2023年，2月20日，星期日一些糖苷酶的分离纯化方法来源酶的名称方法刀豆粉-甘露糖苷酶乙醇沉淀、凝胶过滤、离子交换-N-乙酰己糖胺酶柱层析-半乳糖苷酶无花果-半乳糖苷酶丙酮沉淀、凝胶过滤、离子交换柱层析、等电聚胶产气夹膜梭菌-N-乙酰葡糖胺酶-N-乙酰半乳糖胺酶-半乳糖苷酶硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换柱层析、制备电泳猪肾-甘露糖苷酶硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、热处理(60C，15分钟)、吸附柱层析、凝胶过滤、制备电泳第75页，共111页，2023年，2月20日，星期日亲和层析法分离纯化糖苷酶酶的名称所用的吸附剂-N-乙酰己糖胺酶Sepharose-ConA(刀豆凝集素)-甘露糖苷酶-半乳糖苷酶-半乳糖苷酶葡萄糖醛酸苷酶Sepharose--氨基乙酰甘露糖胺Sepharose-6-氨基乙基-1-硫--D-吡喃半乳糖苷聚丙酰胺-对氨基苯基-硫代半乳糖苷琼脂糖-第76页，共111页，2023年，2月20日，星期日糖苷酶活性测定糖苷酶活性测定：(1)最常用的方法是以合成的对硝基苯酚糖苷化合物作为底物，在酶作用下释放出的对硝基苯酚，在碱性条件下呈黄色，可用分光光度计法定量测定。(2)把伞形酮类萤光化合物(4-Methyumbelliferone)结合到神经氨酸的半缩醛羟基上，生成4-甲基伞形酮基N-乙酰神经氨酸苷，用做神经氨酸苷酸的底物。在酶作用下，释放出发萤光的4-甲基伞形酮，用360nm波长光作激发光，在440nm波长处测发射光，可定量地测定释放的4-甲基伞形圈。第77页，共111页，2023年，2月20日，星期日糖苷酶活性测定(3)需要以合成的或天然的双糖、寡糖、糖肽甚至糖脂作为底物的方法。有两种情况：一是测定糖苷酶作用下从非还原端释放的单糖。用双糖-O-2-L-吡喃岩藻糖基-D-半乳糖为底物。释放出来的岩藻糖，可以转变为三甲基硅醚衍生物，气相色谱上测定。第78页，共111页，2023年，2月20日，星期日糖苷酶活性测定二是在酶作用下，非还原端的糖基释放后，测定其余下的部分。采用萤光化合物(-氨基吡啶,5-二甲氨基萘磺酰基等)标记在底物糖链的还原末端，结合使用高效液相色谱分离，用萤光分光光度计检测酶活性。第79页，共111页，2023年，2月20日，星期日八、糖苷酶的应用在糖链结构研究中的应用作为工具酶的糖苷酶-D-半乳糖苷酶-D-N-乙酰半乳糖胺酶-D-N-乙酰己糖胺酶-D-N-乙酰葡糖胺酶-D-N-乙酰半乳糖胺酶-D-岩澡塘苷酶-L-岩澡塘苷酶第80页，共111页，2023年，2月20日，星期日1、作为工具酶的糖苷酶糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖等糖复合物在生物体内，尤其是在细胞表面携带着生物的信息，在分子识别过程中起着重要作用。研究其功能，首先要研究其结构。阐明一种糖复合物的糖链结构往往需要综合运用多种技术方法包括过碘酸氧化、甲基化反应、红外光谱、核磁共振以及糖苷酶作用等。糖苷酶的使用在糖链结构研究主要体现在以下几个方面：第81页，共111页，2023年，2月20日，星期日(1)外切糖苷酶的作用特点和底物专一性通过糖苷酶水解，能切下非还原末端的一个单糖，同时提供关于糖基的组成、排列顺序以及糖苷键的-或-异头构型的信息。糖基组成，用糖链完全酸水解，加上纸色谱或气相色谱分析得到的结果，可以和应用糖苷酶所得到的结果相印证。第82页，共111页，2023年，2月20日，星期日外切糖苷酶的作用特点和底物专一性糖链中糖基的连接顺序分析，甲基化反应过碘酸氧化和核磁共振等方法，结合糖苷酶的逐步水解方法，可提供顺序的信息。采用核磁共振和红外光谱法分析糖苷键的-或-异头构型。在不具备这些大型仪器的条件下，可采用糖苷酶水解的。第83页，共111页，2023年，2月20日，星期日(2)打开糖肽键获得完整糖链打开O-型糖肽键常用的方法是采用稀碱水解(-消除反应)的方法。打开N-型糖肽键主要采用肼解法。可采用糖苷酶方法打开糖肽键，获得天然的完整糖链。-N-乙酰葡糖胺内切酶H(Endo-H)的应用，在多甘露糖型N-型糖链的研究中，收到良好效果。第84页，共111页，2023年，2月20日，星期日(3)获得短糖链有些植物或微生物来源的糖链，分子量大，并有重复的寡糖结构单位，可以应用合适的内切糖苷酶，将长的糖链打断成为较短的寡糖片段，有利于结构研究。第85页，共111页，2023年，2月20日，星期日2、用于糖链结构研究的外切糖苷酶从肺炎双球菌的培养液中纯化得到-半乳糖苷酶，可以水解Gal--1,4GlcNAc糖苷键，但不能水解-1,3和-1,6键，表现出严格的对取代位置的专一性要求。-半乳糖苷酶常用于N-型糖链的结构分析，因为在N-型糖链中，Gal-G1cNAc之间的连键多为-1,4。第86页，共111页，2023年，2月20日，星期日用于糖链结构研究的外切糖苷酶-半乳糖苷酶-半乳糖苷酶-甘露糖苷酶-甘露糖苷酶-岩藻糖苷酶-N-乙酰己糖胺酶-N-乙酰半乳糖胺酶唾液酸苷酶第87页，共111页，2023年，2月20日，星期日-半乳糖苷酶的底物专一性第88页，共111页，2023年，2月20日，星期日-岩藻糖苷酶的底物专一性第89页，共111页，2023年，2月20日，星期日唾液酸苷酶的底物专一性第90页，共111页，2023年，2月20日，星期日-半乳糖苷酶的底物专一性第91页，共111页，2023年，2月20日，星期日3、用于糖链结构研究的内切糖苷酶内切糖苷酶主要体现在对糖基一侧整个寡糖链的结构有专一要求。它们作用于糖链的中间打断糖苷键，水解产物为分子量小于原来底物的寡糖。第92页，共111页，2023年，2月20日，星期日用于糖链结构研究的内切糖苷酶-N-乙酰葡糖胺内切酶-N-乙酰半乳糖胺内切酶-半乳糖苷内切酶-1,6甘露聚糖内切酶-1,4氨基半乳糖苷内切酶第93页，共111页，2023年，2月20日，星期日几种内切糖苷酶的底物专一性第94页，共111页，2023年，2月20日，星期日第95页，共111页，2023年，2月20日，星期日(1)-N-乙酰葡糖胺内切酶按其来源和底物专一性的差别，共分四种。(1)它们都能水解N-型糖中紧挨着天冬酰胺的两个N-乙酰葡糖胺之间的-1,4连接键。(2)Endo-D和Endo-C1的底物专一性完全相同。都要求在糖基一侧有一个三碳结构。非还原末端的-甘露糖残基必需没有被其他糖取代。第96页，共111页，2023年，2月20日，星期日-N-乙酰葡糖胺内切酶(3)indo-H的底物专一性，在糖基一例要求一个四糖结构:非还原末端的-甘露糖必需是，或者不被取代、或者是仅仅取代在C-2位置上。卵清蛋白糖肽的一条糖链第97页，共111页，2023年，2月20日，星期日-N-乙酰葡糖胺内切酶(4)Endo-C11的底物专一性，在糖基一侧要求一个分枝的五糖单位，并且两个处于还原末端的-甘露糖残基都必需、或者不被别的糖基取代，或者仅取代在C-2位置上。Endo-C11在糖苷配基一侧的专一性要求，和Endo-H一样，不容许有岩藻糖的取代。第98页，共111页，2023年，2月20日，星期日(2)-N-乙酰半乳糖苷内切酶蛋白的O-型糖链中最常见的一种，是由糖链还原末端的N-乙酰半乳糖胺和糖链中的丝氨酸或苏氨酸的羟基以-0-糖苷键连接而成。-N-乙酰半乳糖胺内切酶能够切开这个连键，把0-型糖链和肽链完全分开。第99页，共111页，2023年，2月20日，星期日(3)-半乳糖苷内切酶糖基一侧必须是一个三糖单位，失去非还原末端的半乳糖-乙酰半乳糖胺，都不能成为该酶的底物。糖苷配基一侧必须是N-乙酰葡糖胺或葡萄糖。被酶水解打开的糖苷键必须是-1,4连接。这个内切酶只能用于带有血型A(或B)决定簇的糖链，能作用于血型物质H。第100页，共111页，2023年，2月20日，星期日(4)其他内切糖苷酶来自灰色链霉菌发酵液的一个氨基半乳糖苷内切酶，可以水解-氨基半乳糖苷键。用于一种真菌所产生的氨基半乳聚糖的结构研究。来自一株土壤芽孢杆菌的-1,6甘露聚糖酶，能水解无侧链取代的-1,6甘露糖糖苷键，在研究酵母胞壁外层甘露聚糖结构时，将大分子甘露聚糖外侧链打断，获得靠近天冬酰胺结合位置的内核结构。第101页，共111页，2023年，2月2