经济学第二节其他重要工具酶

经济学第二节其他重要工具酶DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶是催化以DNA或RNA为模板合成DNA的一类酶的总称。经常使用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I()、Klenow酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、耐高温的TaqDNA聚合酶以及反转录酶等。这些DNA聚合酶的共同特点是：它们都能够把脱氧核糖核苷酸(dNTP，包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP)连续的加到双链DNA引物链的3'-羟基末端上，催化核苷酸的聚合，形成新的DNA链。DNA聚合酶IDNA聚合酶I具有三种活性，即5→3聚合活性、5→3外切活性和3‘→5’外切活性。DNA聚合酶

I要发挥作用需满足以下三个条件。①底物和激活剂：DNA聚合酶

I催化聚合反应需要四种dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)作为底物，同时Mg2＋是不可缺少的激活剂。②带有3-端羟基末端的引物：DNA聚合酶

I所催化的聚合反应总是在引物的3-OH末端基团和搀入的dNTP之间发生的，且只能沿引物末端由5→3方向延伸。③DNA模板：可以是ssDNA或dsDNA，后者只有在其主链上有一至数个断裂的情况下才能成为有效的模板。实验室中，利用

DNA

聚合酶I，通过DNA缺口平移的方法制备DNA

探针，可以用于核酸杂交分析。双链DNA

的单链缺口在DNA

聚合酶I的5→3外切作用下，从缺口的5‘端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用缺口的3’端游离羟基逐个加上相应的单核苷酸，使得缺口向下游移动，这种缺口移动的现象就称为缺口平移。如果反应中使用的是用同位素标记过的单核苷酸底物，则合成产生的DNA分子即可作为带放射性标记的DNA分子杂交探针。DNA聚合酶IDNA聚合酶I大片段(Klenow片段)是E.coliDNA

聚合酶I

的蛋白水解产物，特点是：具有DNA

聚合酶活性和3→5核酸外切酶活性，但缺失了5’→3’核酸外切酶活性。Klenow

既保留了全酶的高保真性，又不会降解DNA5末端。用途：在基因工程中主要用于切口平移法标记DNA，同时也可用于DNA

的缺口补平和延伸。用途：用随机引物制备探针补平5突出端，形成平末端切除3突出端，形成平末端合成cDNA第二条链诱变反应中第二条链的合成双脱氧法DNA序列测定(Sanger法)DNA

聚合酶I大片段(Klenow片段)DNA

聚合酶I大片段(Klenow片段)T4DNA

聚合酶在模板及引物存在的条件下，T4DNA

聚合酶催化沿5'→3'方向合成DNA。此酶还具有3'→5'外切核酸酶的活性，该活性比DNA

聚合酶I强。与E.coliDNA

聚合酶I

不同，T4DNA

聚合酶不具有5'→3'外切核酸酶活性。T4DNA

聚合酶■

缺口填充(无链置换活性)

■

产生平末端的最佳用酶

■

补平5'突出端，形成平末端

■

切除3'突出末端，形成平末端

■

通过置换合成法标记探针

■

单链删除后亚克隆

■

基因定点突变中第二条链的合成DNA片段的末端平滑化示例T7DNA聚合酶T7DNA聚合酶是从受T7噬菌体感染的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种复合形式的核酸酶。它由两种亚基组成：一种是T7噬菌体基因5编码的蛋白质，其分子量为84kD；另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白(thioredoxin)，其分子量为12kD。T7DNA聚合酶是目前已知的持续合成能力最强的DNA

聚合酶，能连续合成数千个核苷酸。除聚合活性以外，T7DNA

聚合酶还具有单链和双链的3‘→5’外切酶活性，它的活性也很强，约为Klenow

酶的1000倍。T7DNA聚合酶不具有5‘→3’外切酶活性。由于T7DNA聚合酶的高度续进性和不受DNA二级结构的影响，在分子生物学中常被用于长模板DNA的引物延伸反应。同时，经修饰的T7DNA聚合酶还是双脱氧终止法对长片段DNA进行测序的理想工具酶。T7DNA

聚合酶

碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase）

碱性磷酸酶是一类能特异性地切去DNA或RNA的5‘-磷酸基团的工具酶，它们的作用底物可以是ssDNA或dsDNA或RNA，也可以是NTP或dNTP。用途1）去除DNA片段的5’-末端的磷酸基。防止线状DNA的自身环化（Self-Ligation）。

2）除去PCR反应后残存的dNTP。PCR产物进行测序时，在反应体系中如果有多余的Primer和dNTP，将影响测序反应的正常进行。使用ExonucleaseI分解残存的Primer；用SAP处理可降解多余的dNTP，之后不需要对PCR产物进行精制，立即可以进行测序反应。从细菌中分离的碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase,E.coli

C75;

BAP)从小牛肠中分离的碱性磷酸酶(Alkalinephosphase,calfintestinal,CAP)。从虾提取的虾碱性磷酸酶（ShrimpAlkalinePhosphatase，SAP）

碱性磷酸酶

碱性磷酸酶T4多聚核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase，PNK）

DNA或RNA5'末端的磷酸化，以便进行连接反应。DNA或RNA的末端标记，用作探针和进行DNA测序。

双链DNA片段的磷酸化在微量离心管中配置溶液如下：37℃反应3min,70℃反应5~10分钟使酶失活。进一步用酒精沉淀的方法精制DNA。T4polynucleotidekinase2µlATP(10mM)5µl10reactionbuffer5µl双链DNA片段10pmol

超纯水补足50µlDNA

酶

I

（DNase）DNA酶I（DNaseI）是随机水解双链或单链DNA的一种内切酶，使DNA分子降解成带有5‘磷酸末端的单核苷酸和寡核苷酸的混合物。进行重组DNA研究时，必须注意防止DNA酶的污染，否则制备的DNA样品将会降解。因此使用的器皿或试剂要高温处理，样品中需加EDTA，或放置冰上以破坏或抑制酶活性。

用途1）与DNAPolymeraseI

一起用于切口平移（Nicktranslation）。2）在Mn2+存在的条件下，为鸟枪法测序（Shotgunsequencing）制作DNA文库。3）用于足迹法（Footprinting）分析DNA-蛋白质相互作用。4)DNaseI

可以作用于单链

DNA、双链DNA、染色质和RNA:DNA杂交链。RNA酶A（RibonucleaseA）

RibonucleaseA是一种内切核糖核酸酶，可在C和U残基位置特异性降解单链RNA。该酶可以切割核苷上5’-核糖与邻近嘧啶核苷3’-核糖上磷酸基团之间的磷酸二脂键。产生的2’，3’-环磷酸可以水解成相应的3’-核苷磷酸盐。

产品用途：质粒和基因组DNA制备时用于去除RNA；重组蛋白质制备过程中，除去溶液中的RNA。质粒提取后用RNA酶处理其它的RNA酶RNA酶T1只作用于鸟嘌呤核苷酸的3‘磷酸根，切开与其相邻核苷酸连接的5’磷酸键；

RNaseH

可以降解DNA-RNA杂交链中的RNA分子。防护RNA酶的污染人体的分泌物如唾液、汗液中都含有RNA酶。因此在操作RNA样品时，必须戴手套，实验用的玻璃器皿都要经250℃烘烤4h(RNA酶耐热)，或用RNA酶的抑制剂处理。末端转移酶的主要用途末端脱氧核苷酸转移酶简称末端转移酶，分子量为60kD，来源于前淋巴细胞和分化早期的类淋巴样细胞。在二价阳离子的存在下，该酶能够逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3'-OH末端。末端转移酶在反应过程中不需要模板的存在。对不同的dNTP所需要的二价阳离子不同，若加入的核苷酸是嘧啶核苷酸，则Co2+为首选阳离子；如果加入的核苷酸是嘌呤核苷酸，则Mg2+为首选阳离子。当反应体系中只有一种dNTP时，就可以在DNA分子的3′末端加上同聚物尾巴(homopolymerictail)。末端转移酶的主要用途分别给外源DNA片段和载体分子加上互补的同聚物尾巴，以使它们可以连接起来。例如：可以给用做克隆载体的线性DNA

分子的3'-OH

末端加上poly(dT)尾巴，给待克隆的外源DNA

片段的3'-OH

末端加上poly(dA)尾巴。然后将外源DNA

连接于载体中，形成重组DNA分子。末端转移酶的主要用途DNA连接酶

作用机制及特点DNA连接酶(DNAligase)能利用NAD+或ATP中的能量，催化多段DNA的3‘羟基和5’磷酸末端之间形成3‘，5’-磷酸二酯键，把两个DNA片段连接在一起，封闭DNA双链上形成的切口(见图3-3)。连接酶和限制酶一样是基因工程中不可缺少的重要工具。应当注意，DNA连接酶只能连接双链DNA分子的单链切口(nick)，既不能催化两条单链DNA分子的连接(T4DNA连接酶例外)，也不能催化双链中一个或多个核苷酸缺失所造成的缺口(gap)。DNA连接酶的分类常用的DNA连接酶有T4DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶两种。在这两种连接酶中，最常使用的是T4DNA连接酶，它的连接效率高，既可用于黏性末端的连接，也可用于平齐末端的连接。一般来说，片段越小，末端黏性越强，连接反应则可使用较高的温度。DNA平齐末端的连接比黏性末端连接效率低得多。平齐末端的连接一般需要在10～20℃进行，且需要较高的DNA浓度和T4DNA连接酶的浓度。而黏性末端的连接一般在16～26℃进行。大肠杆菌

DNA

连接酶催化的连接反应中所需要的能量由NAD+提供，

T4DNA连接酶催化的反应中所需要的能量由ATP

提供。其他方面大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA

连接酶的作用机制相同。

各种连接酶特性的比较

反转录酶商品化的反转录酶有两种，一种来自禽成髓细胞瘤病毒(AMV)，另一种来自大肠杆菌中表达的Mo