分子生物学与基因工程主要知识点

分子生物学与基因工程复习重点1从狭义上讲，分子生物学主要是争论生物体主要遗传物质-基因或DNA的构造及其复制、转录、表达和调整把握等过程的科学。之无性生殖和行使正常功能，从而制造生物品种或物种的遗传学技术。2、分子生物学与基因工程的进展简史，特别是里程碑大事，要求把握其必要的理由50年月，Watson和Crick提出了的DNA双螺旋模型；60年月，法国科学家JacobMonod提出了的乳糖操纵子模型；70年月，Berg首先觉察了DNA连接酶，并构建了世界上第一个重组DNA分子；80年月，Mullis制造了聚合酶链式反响〔PolymeraseChainReaction，PCR〕技术；90年月，开展了“人类基因组打算”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代”；目前，分子生物学进入了“后基因组时代”或“蛋白质组时代”。3、分子生物学与基因工程的专业地位与作用：从专业根底课角度阐述对专业课程的支撑作用1、核酸的化学组成〔图画说明〕2、核酸的种类与特点：DNA和RNA的区分DNA含的糖分子是脱氧核糖，RNA含的是核糖；DNA含有的碱基是腺嘌呤〔A〕、胞嘧啶〔C〕、鸟嘌呤〔G〕和胸腺嘧啶〔T〕，RNA3DNA完全一样，只有最终一个胸腺嘧啶被尿嘧啶〔U〕所代替；DNA通常是双链，而RNA主要为单链；DNA的分子链一般较长，而RNA分子链较短。3、DNA作为遗传物质的直接和间接证据；间接：一种生物不同组织的细胞，不管年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半DNA含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相像的分布规律。DNA在代谢上较稳定。DNA是全部生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA。在各类生物中能引起DNA构造转变的化学物质都可引起基因突变。直接：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染试验4、DNA的变性与复性：两者的含义与特点及应用DNA加热至生理温度以上〔100ºC〕时，它就失去生理活性。这时DNA双股链间的氢键断裂，最终双股链完全分开并成为无规章线团的过程。DNADNA的变性过程中，260nm的吸取值先是缓慢上升，到达某一温度后即突然上升的效应。DNA如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重缔合成双螺旋的DNADNA复性的应用-分子杂交：由DNA复性争论进展成的一种试验技术是分子杂交技术。杂交可发生在DNA和DNADNARNA间。5、Tm的含义与影响因素Tm的含义：是指吸取值增加的中点。影响因素：DNA序列中G+C的含量或比例 含量越高，Tm值也越大〔打算性因素〕；溶液的离子强度核酸分子的长度有关：核酸分子越长，Tm值越大某些化学物质 〔5〕溶液pH值6、DNA的一级构造的含义与特点，包括化学本质7、DNA双螺旋模型的觉察过程、根本内容与生物学意义两条多核苷酸链以右手螺旋的形式彼此以确定的空间距离，平行地围绕于同一轴上；两条多核苷酸链走向为反向平行，即一条链磷酸二酯键为5’－3’方向，而另一条为35’方向，二者刚好相反；每条长链的内侧是扁平的盘状碱基，碱基一方面与脱氧核糖相联系，另一方面通过氢键与它互补的碱基相联系。互补碱基对A与T之间形成两对氢键，而C与G之间形成三对0.34nm；3.4nm102nm；在双螺旋分子的外表大沟和小沟交替消灭。生物学意义：双螺旋模型的意义，不仅意味着探明白DNA分子的构造，更重要的是它还提示了DNA(A)总是与胸腺嘧啶(T)(G)总是与胞嘧啶(C)配的碱基挨次也就确定了。因此，只需以其中的一条链为模版，即可合成复制出另一条链。第一次提出了遗传信息的贮存方式以及DNA的复制机理,揭开了生物学争论的序幕,为分子遗传学的争论奠定了根底。3DNA精细构造的含义与重要参数依靠于序列的B-DNA构象变化；连续AT序列的构象；含错配碱基对的B-DNA；DNA的局部构象与DNA结合蛋白4DNA超螺旋构造的形成与鉴定超螺旋DNA可实行两种拓扑学上相当的形式。一种相当于双螺旋绕圆柱体旋转；另一种相当于双螺旋相互盘绕。超螺旋的这两种形式可以相互转变。自然的DNA都呈负超螺旋，但在体外可得正超螺旋5DNA不寻常构造有哪些，有何作用？交替的嘧啶、嘌呤重复序列倾向形成Z-DNA反向重复序列倾向形成十字形构造构成镜像重复的同型嘧啶-DNA过程中游离出DNA对S1DNA含有镜像重复，故可形成两种异构体：一是多聚嘌呤链的5’局部成单链；另一是3’局部成单链。富含GDNA端，富含G53’-末端延长，并突出于互补的富含C12～16核苷酸〔以以以下图〕。染色体的末端与特定的蛋白质形成复合物。1染色体是由染色质〔chromatin〕构成的，染色质是由DNA、RNA和蛋白质形成的复合体。染色体是动态的物体，其外观随细胞周期的不同阶段发生明显的转变。仅当细胞分裂时，每个染色体才呈现出分散型。组蛋白：组蛋白在翻译后是受到修饰的，其中包括特异精、组、赖、丝和苏氨酸残基的甲基化、乙酰基化和磷酸化核小体30nm纤丝辐射的环2C值与特点在真核生物中，每种生物的单倍体基因组的DNA总量是恒定的，称之为C值。〔名词解释〕特点：3、基因组中DNA的大小、外形与序列组织：包括卫星DNA和微卫星DNA的含义DNA一般为长而无分支的双股线性分子，但有些为环型，也有少数为单股环型。不同的DNASV40含5.1kb102000000kb。虽然一般而言，简洁的有机体需要更多的DNA，但不存在严格的对应关系。真核生物DNA碱基组成上的异质性主要由于存在着以下3类DNA列；②中度重复序列；③单一序列。DNA序列的碱基组成和浮力密度与主体DNA梯度离心时，可形成相对独立于主DNA带的卫星带。这些卫星带称为卫星DNA。DNA是由更简洁的重复单位组成的小序列，分散于基因组中，大多数重复单位是二核苷酸，也有少量三或四核苷酸的重复单位。4〔与原核生物比较〕真核生物基因组与原核生物的相比，主要有以下几方面的差异〔特点〕：分布部位基因特性遗传信息的传递过程自身的复制过程1、蛋白质的含义蛋白质一词最早来自希腊语“proteios”，其含义为“第一重要的”。20种左右的-氨基酸通过肽键相互连接而成的一类具有特定的空间构象和生物学功能的高分子有机化合物。1、蛋白质一级构造的含义11、蛋白质一级构造的含义肽链，故肽键是蛋白质构造中的主键。2、蛋白质二级构造的类型，包括阿尔法构造与DNA双螺旋的异同点α-螺旋、β-折迭、β-转角、无规章卷曲〔填空题〕多个肽键平面通过α-碳原子旋转，相互之间严密盘曲成稳固的右手螺旋；3.60.54nmX衍射图符合；相邻两圈螺旋之间借肽键中C＝O和硫氢基形成很多链内氢健，即每一个氨基酸残基中的NH和前面相隔三个残基的C＝O之间形成氢键，这是稳定α-螺旋的主要键；肽链中氨基酸侧链Rα-螺旋的形成。酸性或碱性氨基酸集中的区域，由于同电荷相斥，不利于α-螺旋形成；较大的R(如苯丙氨)集中的区域，也阻碍α-螺旋形成；脯氨酸因其α-碳原子位于五元环上，不易扭转，加之它是亚氨基酸，不易形成氢键，故不易形成上述α-螺旋；甘氨酸的R基为H，空间占位很小，也会影响该处螺旋的稳定。1、蛋白质构造与功能的关系蛋白质一级构造与功能的关系：蛋白质一级构造是空间构造的根底，特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R基团形成的次级键来维持，在生物体内，蛋白质的多肽链一旦被合成后，即可依据一级构造的特点自然折叠和盘曲，形成确定的空间构象。蛋白质空间构象与功能活性的关系：蛋白质多种多样的功能与各种蛋白质特定复性后，构象复原，活性即能恢复。血红蛋白是红细胞中所含有的一种结合蛋白质，它的蛋白质局部称为珠蛋白，非蛋白质局部(辅基)称为血红素〔x〕DNA复制1、一些根本概念：复制子、复制单元、复制起始点、半保存复制、半不连续复制、前导链、随后链、冈崎片段。DNA板各自合成一条的DNA链，这样合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，半保存复制。：亲代双链DNA以每条链为模板，按碱基配对原则各合成一条互补链，这样一条亲代DNA双螺旋，形成两条完全一样的子代DNADNA为半保存复制。连续合成的链比不连续合成的链超前一步，称为前导链。2、不连续合成的链要滞后一步，称为后随链。前导链连续复制和后随链的不连续复制，称为DNA的半不连续复制。成，这些片段就叫做冈崎片段。复制是从DNA分子上的特定部位开头的，这一部位叫做复制起始点。生物体的单个复制单位称为复制子。1、 要求把握DNA定点双向复制〔画图说明〕4、单链结合蛋白的作用它与解开的单链DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避开核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBP可以重复利用。5、DNA复制的酶学根底及原核生物复制的一般过程，包括DNA复制前导链和随后链的起始、延长和终止〔包括图讲解明〕6、真核生物DNA复制的特点〔与原核生物比较〕与原核生物不同，真核生物DNA复制有很多起始点在真核生物DNA复制叉处，需要两种不同的酶。由于真核生物染色体是线性DNA列构成的。真核生物具有多重复制原点，原核生物只有一个。RNA生物合成及其加工1、一些根本概念：不对称转录、编码链〔信息链〕、模板链、启动子、转录因子在DNADNA双链中另一条不做为模板的链叫做编码链，又叫有意义链。编码链的的序列与转录本RNA的序列一样，只是在编码链上的T在转录本RNA为U，由于RNA的转录合成是以DNA转录。DNA分子上被RNA一些调整蛋白因子的结合序列。转录因子：但凡转录起始过程必需的蛋白质，只要不是RNA聚合酶的组成成分，就可以将其定义为转录因子。2、RNA生物合成的酶学根底：包括该酶的组成与特点3、原核生物DNA转录的根本过程，包括启动子的识别、起始、延长和终止5、原核生物转录与复制的主要区分45、原核生物转录与复制的主要区分6、mRNA加工根本过程：要求把握帽子与尾巴构造的名称与作用及形成过程5端形成帽子构造(m7GpppNp—)3端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)中部剪接除去内含子链内部核苷酸的甲基化mRNA帽子的生理功能：⑴帽子构造参与翻译起始，帽0构造是核糖体识别mRNA所必需的；核糖体上有帽结合蛋白。⑵帽子构造增加mRNA的稳定性，保护mRNA防5′核酸外切酶的降解。⑶促进某些RNA的合成。尾巴：7、tRNA加工根本过程：要求把握氨基酸臂名称、加工酶系及碱基修饰方式⑴剪切内含子3´末端，逐个切去附加序列；⑶加上CCA-OH3´末端，完成柄部构造。⑷碱基修饰1、蛋白质合成的物质根底包括哪些方面合成原料mRNA是合成蛋白质的直接模板tRNA是氨基酸的运载工具核糖体-蛋白质的合成场所蛋白质生物合成的必需因子2、遗传密码的特点及解析起始码：绝大多数生物的起始密码子都是AUG，作为多肽链合成的起始信号，同时编码一种氨基酸，原核生物的起始密码子AUG翻译对应的是甲酰甲硫氨酸，真核生物的起始密码子AUG翻译对应的是甲硫氨酸。终止码：密码子UAA、UAG、UGA并不编码任何氨基酸，起着终止肽链合成的作用，因此成为终止密码子。密码无标点符号密码的简并性：简并性主要是由于密码子的第三个碱基发生摇摆现象形成的，也就是说密码子的专一性主要由前两个碱基打算，密码的通用性：蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。但已觉察少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。3、核糖体作为蛋白质或多肽装配机器的缘由核糖体作为蛋白质的合成场所mRNAtRNA位、tRNA位、转肽酶活性部位及蛋白质合成起始因子IFEF和终止因子RF的结合部位。4、原核生物蛋白质合成的根本过程，包括氨基酸的活化、合成的起始、多肽链的延长与释放。5、多核糖体循环的含义事实上在细胞内一条mRNA成时，第一个核糖体在mRNA的起始部位结合，引入第一个蛋氨酸，然后核糖体向mRNA的3mRNA的起始部位结合，向前移动确定的距度间隔，每个核糖体都独立完成一条多肽链的合成，所以这种多核糖体可以在一条mRNA链上同时合成多条一样的多肽链，这就大大提高了翻译的效率。1、一些根本概念：基因表达、基因表达组织特异性、基因表达阶段特异性、组成性表达、适应性表达、顺式作用元件、反式作用元件基因表达：指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。基因表达组织特异性：遗传信息的表达是受到严风格控的，通常各组织细胞只合成其达的强度和种类也各不一样，这就是基因表达的组织特异性。基因表达阶段特异性：细胞分化发育的不同时期，基因表达的状况是不一样的，这就是基因表达的阶段特异性。组成性表达：指不大受环境变动而变化的一类基因表达。适应性表达：指环境的变化简洁使其表达水平变动的一类基因表达。顺式作用元件：指DNA上对基因表达有调整活性的某些特定的调整序列，其活性仅影响与其自身处于同一分子的基因。反式作用元件：调控基因可以在构造基因群四周、也可以远离构造基因，它是通过其基因产物-DNA链上的构造基因起表达调控作用，而且能对不在一条DNA链上的构造基因起作用，在遗传学试验上称为反式作用，调控基因就属于反式作用元件。2、乳糖操纵系统的组成局部及作用乳糖操纵元含有z、ya三个构造基因。z3510bp，编码含1170个氨基酸、分子量为135kDβ-再分解为半乳糖和葡萄糖；y780bp26030kD的半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌；a825bp275氨基酸、分子量为32kD的转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。3、乳糖操纵子模型的根本内容及在分子生物学中的地位操纵元是原核基因表达调控的一种重要的组织形式式组成基因表达调控的单元。在分子生物学中的地位：重要的里程碑4、真核生物基因表达调控的特点〔与原核生物比较〕真核基因表达调控的环节更多真核基因的转录与染色质的构造变化相关真核基因表达以正性调控为主1、一些根本概念：工具酶、粘性末端、平末端、同位酶、同尾酶、同裂酶、酶活力单位工具酶：在DNA分子水平的操作中，依靠于一些重要的酶，如限制性核酸内切酶、连接酶等，作为工具对DNA进展切割和拼接，这些酶统称为基因工程工具酶黏性末端：大多数限制性核酸内切酶并不是在DNA两条链的同一个位置切断，而是2~4DNADNA单链，这种末端称为黏性末端。平末端：有些限制性核酸内切酶能够在识别序列中间的同一个位置将DNA双链切断，产生的DNA末端是平末端。同位酶：识别一样的序列但切割位点不一样的限制性核酸内切酶。同尾酶:很多不同的限制性核酸内切酶识别序列虽然不完全一样，但切割DNA产生的末端是一样的，这些酶统称为同尾酶。同裂酶：具有一样识别序列的限制性核酸内切酶称为同裂酶。酶活力单位：在适当的反响条件下(包括温度、pH和离子强度等),1h50μl容积中1μg特定DNA底物(通常用λDNA)所需要的酶量。2、基因操作工具酶的分类与举例说明限制性内切酶：已觉察的内切核酸酶分为三类：即I型、II型、III型酶型和III型酶在同一蛋白酶分子中兼有甲基化酶及限制性内切核酸酶活性，又因其识别位点与切割位点不固定，所以价值不大型酶切割DNA片断活性和甲基化作用是分开的在基因克隆中广泛使用通常所用的限制性内切核酸酶是指II型的DNA聚合酶①大肠杆菌DNA聚合酶I；②KlenowDNA聚合酶；③T4DNA聚合酶；④T7噬菌体DNA聚合酶；⑤耐热DNA聚合酶；⑥逆转录酶DNA连接酶①T4DNA连接酶；②大肠杆菌DNA连接酶：③T4RNA连接酶3、限制性内切酶的含义、分类、命名、特点与影响因素含义：是一类能够识别双链DNA分子中某些特定的核苷酸序列，并在该序列切割DNA双链的核酸内切酶。23种类型：I型酶、II型酶、III型酶。命名：承受Smith和Athens提议的方案，依据限制性内切核酸酶来源和菌株进展命名①用来源细菌的英文缩写斜体符号命名；②它的第一个字母大写，来源细菌属名的第1个字母；③其次、三字母小写，来源细菌种名的头2个字母；④第四个字母代表菌株；⑤最终用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号。特点：专一性:一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子多样性:200多种影响因素：①星活性②DNA样品的纯度③DNA的甲基化程度④DNA的分子构造⑤侧翼序列长度4、DNA连接酶的含义、种类及作用机理含义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸暴露的3＇羟基和5＇磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。种类：①T4DNA连接酶；②大肠杆菌DNA连接酶：③T4RNA连接酶作用机理：DNA中，DNA3’-5’-磷酸基的单链形成磷酸二酯键，促使具有互补粘性末端或平末端的载体和供体DNA片段连接，使之成为一个完整的重组DNA分子。连接的部位：磷酸二酯键〔梯子的扶手〕，不是氢键〔梯子的踏板〕。结果：黏性末端〔包括平末端〕连接起来。1、载体的含义与特点(Vector);即用于克隆、运载和转移目的基因并能自我复制的DNA分子。载体特点：能在宿主细胞中复制并稳定地保存---具复制原点。:在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能与携带的外源DNA一起复制能与目的基因连接---具多个限制酶切点，而每一个这样的酶切位点在载体DNA中只有一个〔广泛、特异〕便于筛选鉴定---，而宿主细胞并不具有操作简洁--分子量小,高拷贝数，转化效率高,简洁从宿主细胞中分别纯化2、载体的主要类型①细菌质粒载体〔10kb)包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体②λ噬菌体衍生载体(9-23kb)③柯斯质粒(Cosmid)载体(40-50kb)一种由质粒和λ噬菌体cos尾巴构建复合载体④M13载体一类特地用于Sanger法测序的载体⑤Phagemid载体一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合载体3、质粒载体的特点与作用〔图解分析〕4、蓝白斑筛选的根本原理pUC18/pUC19上含有一个LacZ基因的调控序列和编码β-半乳糖苷酶N146个氨基酸的序列〔α-互补肽〕的DNA序列〔标记为lacZ’〕，多克隆位点就存在于lacZ’上。β-半乳糖苷酶的C端编码基因却位于相应的宿主菌上。-半乳糖苷酶结合才会形成一个有活性的β-半乳糖苷酶。这种机制称为α-互补作用。LacZ〔编码β半乳糖苷酶X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。5、基因表达载体与克隆载体的区分克隆载体是在克隆过程中用到的各种质粒，比方为了扩增目的基因的高拷贝质粒、为了便利PCR产物的TA质粒、为了重组的穿梭质粒等等。克隆载体强启动子，由于不重于表达。样的启动子适应于不同种类的细胞，并且有各种各样，如诱导等可控的表达调控方式。6、真核生物载体〔pEGFP-N1载体〕的类型与特点生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCM③具有多克隆位点，便于目的基因的插入；④该载体具有neo基因，可以承受G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。1、分子杂交技术的分类及根本原理配对原则结合成杂化双链的过程。杂交的双方分别称为探针和待测核酸。2、PCR技术的根本原理〔包括反响体系和反响进程〕PCR反响体系主要由寡核苷酸(引物)4dNTPTaqDNADNA和PCR反响缓冲液体系组成。94℃预变性5~10min，9430s~2min，退火30s~2min，721~5min725~10min，中间三步循环，具体时间依自己的模板和引物状况而定。3、PCR的主要类型及应用反转录PCR〔RT-PCR〕反转录PCRmRNA作为模板，进展反转录合成cDNA的PCR方法其样品模板为mRNA。一般分两步进展：第一步用反转录酶将RNA反转录成cDNA，其次cDNA为模板进展PCR扩增目前已觉察一种rTth酶，既有反转录酶活性又有DNA聚合酶活性。因此做RT-PCR可简洁到用一种酶和一种缓冲体系在一个反响管内直接扩增RNA巢式PCR巢式PCR是指用两对引物先后扩增同一样品的方法。先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段DNA，再用一对内侧引物以大片段DNA为模板扩增目的基因优点：较常规PCR灵敏度大大提高，同时其次次扩增又可鉴定第一次扩增产物的特异性用于临床检验〔如血清中丙型肝炎的检测〕多重PCR在反响中用多组引物同时扩增根本称复合PCR在同一反响中参与多对引物，以一个DNA分子为模板,同时扩增几种不同序列的PCR片段的方法用于同一病原体分型及同时检测多种病原体；多点突变性分子病的诊断荧光定量PCR是用PCR方法对样品起始模板浓度进展定量分析的一种方法通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进展标记跟踪，结合相应的软件对产物进展分析，计算待测样品的初始模板量用这一方法对组织细胞中的特定mRNA进展定量分析，从而了解某一基因的表达水平。原位PCR利用PCRDNA片段进展扩增，然后再用原位杂交对扩增产物进展定量分析的一种方法原位PCR与PCR相比，不需抽提组织细胞中的核酸，形态构造不被破坏；比原位杂交灵敏100倍。4、影响PCR的主要因素1、预变性2、循环中的变性步骤3、引物退火4、引物延长5、循环数6、最终延长5、两种DNA测序技术的根本原理与比较6、生物芯片技术的种类与特点生物芯片的主要特点：高通量、微型化和自动化生