上海市临检中心 PCR培训班 核酸化学与聚合酶链反应

核酸化学与聚合酶链反应

上海交通大学医学院医学检验系临床分子生物学和生物化学倪培华nipeihua@126.com

1第一部分核酸化学

BiochemistryofNucleicAcid

220世纪40年代明确了遗传的物质基础是DNA:

肺炎球菌320世纪50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制420世纪50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码中心法则5遗传密码64个密码子

61个代表各种氨基酸（AUG起始密码）

3个密码子为终止子（UAA、UAG、UGA）6操纵子

用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质7核酸（nucleicacid)脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)—贮存细胞所有的遗传信息，是物种保持进化和世代繁衍的物质基础核糖核酸(ribonucleicacid，RNA)—参与蛋白合成的有3类：第一节核酸化学概述信使核糖核酸(messengerribonucleicacid,mRNA)转运核糖核酸(transferribonucleicacid,tRNA)核糖体核糖核酸(ribosomeribonucleicacid,rRNA)8嘧啶嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶尿嘧啶腺嘌呤鸟嘌呤核苷酸核苷磷酸碱基戊糖脱氧戊糖核糖核苷酸(nucletide)9DNARNA腺嘌呤（A）腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（U）10核苷中的戊糖5’碳原子上羟基被磷酸酯化11常见核苷酸名称12第二节核酸的分子结构

13多核苷酸链中核苷酸的排列顺序（碱基）核酸的一级结构14DNA中各脱氧核苷酸的排列顺序四种脱氧的单核苷酸按照一定的顺序以3’5’磷酸二酯键连接而形成的多核苷酸链

DNA的分子结构（一）DNA的一级结构15

不同种生物DNA分子中的核苷酸排列顺序不同(有种族特异性)同种生物不同组织器官细胞中DNA分子的核苷酸排列顺序相同(无组织器官特异性)某一特定生物，其DNA碱基组成恒定任何生物DNA碱基组成都符合

A=T，G=C，A+G=T+CChargffLaw16Watson-Crick双螺旋结构学说（doublehelixstructure）（二）DNA的二级结构维持DNA二级结构稳定性的因素碱基对间氢键碱基的堆积力范氏引力疏水键正负电荷作用

17（三）DNA的三级结构—DNA链进一步扭曲盘旋形成超螺旋结构18一条DNA的长链经过一级结构即形成核小体后,其长度被压缩了7倍二级结构,即形成螺旋管后,DNA长度又被压缩了6倍三级结构,即由螺线管形成超螺线管后,DNA的长度在二级结构的基础上被压缩了40倍在由三级到四级结构,即形成染色单体后,DNA的长度在三级结构的基础上被压缩了5倍（四）DNA的四级结构1920TypesofRNARNAmRNAncRNANon-codingRNA.TranscribedRNAwithastructural,functionalorcatalyticrolerRNARibosomalRNAParticipateinproteinsynthesistRNATransferRNAInterfacebetweenmRNA&aminoacidssnRNASmallnuclearRNAIncl.RNAthatformpartofthespliceosomesnoRNASmallnucleolarRNAFoundinnucleolus,involvedinmodificationofrRNAmiRNAMicroRNASmallRNAinvolvedregulationofexpression

OtherIncludinglargeRNAwithrolesinchromotinstructureandimprintingsiRNASmallinterferingRNAActivemoleculesinRNAinterferencestRNASmalltemporalRNA.RNAwitharoleindevelopmentaltiming20mRNA的结构占细胞中总RNA的１%-５%不均一分子有编码序列与非编码序列21５’端：翻译起始序列;３’端：翻译终止序列少量的间隔序列无帽无尾原核生物mRNA的结构22真核生物成熟mRNA结构５’端帽子结构:经甲基化修饰,以5’,5’-磷酸二酯键相连的GTP.(m7G5’ppp5’Np)

功能：与蛋白质合成起始及保护mRNA不易被降解有关３’端尾结构３’端：20-250个多聚腺苷酸结构（polyA）。polyA不是转录产物功能：稳定mRNA2324TypesofRNARNAmRNAncRNANon-codingRNA.TranscribedRNAwithastructural,functionalorcatalyticrolerRNARibosomalRNAParticipateinproteinsynthesistRNATransferRNAInterfacebetweenmRNA&aminoacidssnRNASmallnuclearRNAIncl.RNAthatformpartofthespliceosomesnoRNASmallnucleolarRNAFoundinnucleolus,involvedinmodificationofrRNAmiRNAMicroRNASmallRNAinvolvedregulationofexpression

OtherIncludinglargeRNAwithrolesinchromotinstructureandimprintingsiRNASmallinterferingRNAActivemoleculesinRNAinterferencestRNASmalltemporalRNA.RNAwitharoleindevelopmentaltiming24转录后基因沉默(PTGS)的发现目的：1990年美国人纳波里利用转基因技术将一种催生红色素的CHS基因插入牵牛花中，期望得到更艳丽的花朵ThePlantCell,2,279-289,1990结果：原来开紫花的花色没有加深，花瓣变成了白色，或杂色2526Double-strandedRNAinjectsenseantisense1998年，AndrewFire等首次将正义链反义链RNA混合注入线虫C.elegans中，观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNAinterference的概念2627Acontrol:notstainedB:wtC:wt+antisenseRNAD:wt+dsRNAMex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridization27282000年，RNA的研究进展被美国《科学》杂志评为重大科技突破2001年“RNA干扰”作为当年最重要的科学研究成果之一，再次入选“十大科技突破”2002年12月20日，Science杂志将“SmallRNA&RNAi”评为2002年度最耀眼的明星。Nature杂志亦将SmallRNA评为年度重大科技成功之一2003年，小核糖核酸的研究第四次入选“十大科技突破”，排在第四位28293031微RNA（microRNA,miRNA）3233PrecursorofmiRNADicerantisensemiRNAmiRNPLin-4抑制mRNA的翻译

ThemechanismofmiRNAsilencing分解mRNAGrisbok,Pasquinelli.Cell

,106:23-34,2001.33一、核酸的大小

DNA：人单倍体细胞中为2.9109bpRNA：分子较小第三节核酸的理化性质二、核酸的水解1、化学法

低pH发生磷酸二酯键水解高pHRNA的磷酸酯键易被水解，DNA则不易被水解2、酶法①按底物专一性：

核糖核酸酶（RNase）、脱氧核糖核酸酶（DNase）②按对底物作用方式

核酸外切酶：5’3’外切酶、3’5’外切酶核酸内切酶：多核苷酸内部的磷酸二酯键34核酸外切酶：5’3’外切酶3’5’外切酶

5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…A-C-T-T-A-A-G-C…5’35核酸内切酶：多核苷酸内部的磷酸二酯键5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’5’…G-C-T-G-3’5’-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-5’3’-G-C-T-C…5’36１、变性（denaturation）三、核酸的变性、复性与杂交37解链曲线（熔解曲线，meltingcurve）融解温度meltingtemperature(Tm)

—在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度382、核酸的复性(renaturation)（退火，annealing）变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程

影响复性速度的因素：

DNA浓度

DNA片段的大小

DNA片段复杂性

合适的复性温度

适当的离子强度

393、杂交（hybridization）两条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分子杂交40第二部分聚合酶链反应

(PolymeraseChainReaction,PCR)411985年美国PE-cetus公司人类遗传研究室的Kary

mullis发明了具有划时代意义的PCR技术1988年

美国PE-cetus公司推出世界上第一台PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化1993年

KaryMullis因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖1995年定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实PCR技术的诞生与发展42PCR反应原理和反应过程（一）DNA的体外复制的步骤：变性（denaturation）

退火（annealing）

延伸（extension）

模板DNA引物4种脱氧核糖核苷酸DNA聚合酶其他（二）PCR基本组成：43DNA体内复制半保留复制

（semiconservativereplication）44DNA的体外复制45靶序列靶序列靶序列靶序列Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’46靶序列靶序列Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’Taq

DNAPolymerase4730次循环后靶序列扩增的数量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon48PCR扩增过程图示49PCR演示50指数增长期线形增长期平台期循环数#

理论值

实际值Log产物DNAPCR过程的实时监测5152AFTER1CYCLE

100% =2.00x

90% =1.90x

80%=1.80x

70%=1.70x

53逆转录生成cDNA方式以PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物，mRNA3’末端polyA尾与之互补以人工合成的随机序列（6bp)混合物作为引物54DNA链中的戊糖在3’位碳原子上有-OH基团，在DNA合成、链的延长过程中，新掺入的脱氧核苷酸5’-p与前一核苷酸的戊糖3’-OH以磷酸二酯键相连Sanger法是在反应体系中加入2’,3’-ddNTP，由于其没有3’-OH而不能与下一个核苷酸相连，于是DNA链的合成便终止双脱氧链终止法（Sanger法）DNA序列分析

5556设计沙眼衣原体引物（Chlamydiatrachomatis，CT）确定拟要研究的基因:CTGenbank中找到相应的基因序列

采用引物设计软件进行引物的设计

http:///确保引物的特异性，将设计好的序列在

www.ncbi.nlm.nih/blast

中核实57第三部分实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)58荧光定量PCR与常规PCR的区别常规PCR技术

对PCR扩增的终产物进行定性及定量分析荧光定量PCR技术

实时监测PCR扩增反应中每一个循环的产物定量分析59实时荧光定量PCR的特点特异性强灵敏度高可直接对产物进行定量解决PCR污染问题自动化程度高、操作简单60PCR

即每个循环后扩增子增加一倍。然而到了一定时候，原料和酶相对于模板大大减少，PCR的效率就会降低，直至为0。所以实际的扩增曲线是“S”型的，而不是“J”型理想：J型，2N

方程实际：S型不可检测期指数期平台期RealtimePCR同样不能直接测出初始DNA的分子数,但采用的数据是在PCR中期，比末期定量要准确（更接近理想情况）61常用的荧光定量PCR方法SYBRGreenITaqman水解探针分子信标62SYBRGreenI结合到双链DNA的小沟部位只有与双链DNA结合后才发荧光SYBR与dsDNA

结合，并且受到激发的时候，可以发出绿色荧光63SYBRGreenI工作原理未结合的SYBRgreenI64SYBRGreenI工作原理65SYBRGreenI的特点可以用于不同的模板使用方便，价格相对便宜灵敏度很高与非特异性产物结合融解曲线选择良好的引物和探针并优化反应条件6667TaqManProbes荧光素淬灭剂

与目标序列互补FAMTETJOEHEXTAMRATaqMan

探针的机理DNA聚合酶在延伸阶段将探针切碎，使荧光基团和荧光淬灭基团分开，于是荧光得以检测68697071TaqManProbes工作原理

光能量转移Taq游离的探针荧光基团

淬灭剂

延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号Taq发出荧光光另一波长的荧光72分子信标(发夹型杂交探针)荧光基团茎由互补配对的序列组成环与目标序列互补

淬灭剂

茎(5-7bp)

环（15-30bp）FAMTexasRed73分子信标工作原理探针与DNA模板杂交光发出荧光荧光基团DNA模板淬灭剂

茎

环光74Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号与模板数成正比固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比初始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量Threshold10410310275定量PCR相对定量提供一种在不需要知道目的基因具体量时