分析基因差异表达的几种方法

分析基因差异表达的几种方法罗永华;丁兆忠【摘要】@@随着人类和很多动物的基因组测序完成,以基因组功能研究为主要目标的后基因组时代的来临，基因功能信息的获取将成为基因研究的重点.基因差异表达分析是获取基因功能信息的重要方法.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷)，期】2010(046)004【总页数】3页(P65-67)【作者】罗永华;丁兆忠【作者单位】河北沧州职业技术学院，河北，沧州,061001;河北沧州职业技术学院，河北沧州,061001【正文语种】中文【中图分类】Q786随着人类和很多动物的基因组测序完成,以基因组功能研究为主要目标的后基因组时代的来临，基因功能信息的获取将成为基因研究的重点。基因差异表达分析是获取基因功能信息的重要方法。高等生物大约有3~5万个不同的基因,在每一个正常的体细胞中都含有相同的基因组拷贝，但在不同的组织细胞中仅有10%~20%的少部分基因被选择性表达，它将最终控制生物的形态和生理过程,是调控细胞生命活动过程的核心机制。了解不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下的基因表达状况，可为研究生命活动过程提供重要信息，对调控生物的生长发育各阶段及代谢途径具有重大的理论和实践意义。目前常用研究基因差异表达的方法有:mRNA差异显示技术(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionPCR,DDRT-PCR),抑制消减杂交(suppressionsubstractivehybridization,SSH),基因表达系列分析技术(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)和基因芯片(genechip)。本文对这几种方法进行了简要的综述和比较。1mRNA差异显示技术1992年Liang和Pardee建立了mRNA差异显示技术［1］。根据成熟的mRNA3'端具有poly(A)尾巴这一特性，以一系列olige(dT)12MN弓物中的一种(M=A、C、G,N=A、C、G、T),用此弓物对来自两种或两种以上对比材料的mRNA进行反转录，形成cDNA,并用此弓物锚定cDNA第二条链的3'端，用另一条随机寡核苷酸弓物与cDNA第一链互补进行PCR扩增。由于寡核苷酸随机结合在cDNA的互补靶点上，来自不同mRNA扩增片段的大小是不同的，利用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳，对PCR扩增产物进行分离,并可显示差异表达的cDNA片段。mRNA差异显示技术，具有起始RNA用量少(仅需0.2pg总RNA作为起始材料)、简便快速、准确、灵敏度高,可同时比较多个样品，并可以通过PCR获得全长来深化分子及功能特性的研究等优点。目前已广泛用于发育生物学、神经科学、病理学、内分泌学、植物生理等方面的研究。但也存在一些问题，如出现差别的条带太多，电泳显示的差异条带不能用Northernblot完全验证，假阳性率有时高达70%以上［2］;扩增片段的分子长度较短，一般不大于600bp;其中某些片段源自差异表达的基因，某些源自组成型表达的基因;检测到的往往是3'端出现差异的基因，使上游的差异表达信息得不到检测;此外还有重复性较差，不能检测低丰度mRNA。为了克服以上的缺点,mRNA差异显示技术得到了许多改进:最初的DDRT-PCR其3'端为T11MN(M=A、C、G,N=A、C、G、T)的锚定引物有12个组合，因此要全面分析总mRNA的差异工作量巨大，且在变性胶中容易产生smear带［3］,因此改^T11M（M=A.C、G）,这样将总mRNA分为3个亚群，这样大大减少了DDRT-PCR的工作量，避免了smear状态;随机引物也由10个碱基增加到了13、18、25个等等,这样不但可以提高重复性,避免过多的差异条带出现,还可以尽量覆盖所有的差异表达基因。将差异条带利用反向Northernblot杂交验证大大降低了假阳性［4］。此外还在RNA提取后采用DNA酶消化处理来减少DNA污染,PCR扩增条件的优化，电泳条件等方面做了一些改进。2抑制消减杂交1996年,DiatchenkoL等［5］建立了一种新的以PCR反应为基础的cDNA消减杂交方法，称为抑制消减杂交。该方法运用了杂交二极动力学原理,即高丰度单链cDNA在退火时产生同源杂交速度快于低丰度的单链cDNA,从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致。而所谓抑制PCR,则是利用链内退火优先于链间退火的规律使非目的序列片段3’端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法与引物配对从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。这种方法克服了以往任何一种差减方法的技术限制，在差减杂交的过程中使不同丰度cDNA拷贝数差异趋于均衡，因此不同丰度的差异表达基因都能得到有效克隆。杂交双方为Tester和Driver,首先提取待比较的两组细胞的mRNA,反转录为cDNA,经限制性内切酶消化后,将分为两份,分别接上不同的接头，分别向两个样品中加入过量的，于杂交缓冲液中进行杂交反应。第一轮杂交反应完毕后，将两个样品混合,再加入过量变性的继续杂交。两轮杂交后的群体经末端补平后，用与接头外测序列对应的一对巢式引物进行第二次PCR扩增,二次扩增的PCR产物既可直接用于构建差减cDNA文库，又能用做杂交探针对文库进行差示筛选,筛选出来的克隆经杂交验证后,可进行测序分析。SSH技术有许多优点,主要表现在以下几个方面:基于杂交动力学原理使不同丰度的mRNA分子趋于一致,SSH克服了不同mRNA分子拷贝数目不同对杂交结果的影响从而大大提高了差减的灵敏度。仅需一轮差减杂交，即可对差异表达的cDNA分子达到1000多倍的富集［6］,保证了低丰度mRNA的检出。速度快,效率高，一次SSH可以同时分离到几十甚至几百个差异表达的基因。阳性率可高达94%［7］。SSH技术也存在一些缺点:需要较多的起始材料，不能同时进行数个材料之间的比较,对材料的要求也较高，存在小片段缺失时也不能有效检测。3基因表达系列分析技术基因表达系列分析是VelculescuVE等［8］在1995年建立的一种快速而高效地大规模研究基因表达的方法,其主要依据两个理论：(1)—个来自转录物内特定位置的一个短的寡核苷酸序列(9~11bp),含有鉴定一个转录物特异性所需的足够信息，可以作为区别转录物的标签。(2)这些标签可以通过简单的方法串联在一起，形成大量多联体(concatemer),对每个克隆到载体的多联体进行测序并应用SAGE软件分析，可确定表达的基因种类，并根据标签的数量来确定基因的表达丰度。SAGE技术流程主要包括:提取mRNA,以生物素化的oligodT为引物反转录合成双链cDNA。锚定酶(anchoringenzyme,AE)酶切生物素标记的cDNA,如NlaIII作为锚定酶。锚定酶酶切产物通过生物素磁珠分离含有3'端poly(A)尾巴的cDNA片段。将cDNA酶切片段等分为A和B两部分，分别与设计好的两种连接子A或B结合。每一种接头都含有标签酶(taggingenzyme,TE)酶切位点序列，标签酶是一种H类限制酶,它能在距识别位点约20碱基的位置切割DNA双链。用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段(约9~10碱基)，即释放cDNA标签。连接产物A和B经标签酶酶切后,产生的两个含有接头序列和标签序列的短cDNA片段混合，进行平端连接。用接头引物A和引物B扩增双标签，用锚定酶酶切扩增产物,并分离双标签。含有粘性末端的双标签连接形成含多标签连接子，克隆并测序。测序结果采用SAGE分析软件对标签数据进行处理。统计原始序列中每个标签序列、数目及其发生率，生成相应的报告和丰度指标,分析整理数据。比较SAGE文库标签的丰度，分析其意义°rsv^^。基因表达系列分析是一种高效、快捷、低成本的研究生物基因表达水平的方法，可在整体水平对细胞或组织中的大量转录本同时进行分析，从而全面反映细胞或组织中的基因表达情况,同时还可进行不同组织或细胞的所有差别表达基因的比较和研究。但由于SAGE程序的复杂性，在应用过程中还存在一些问题，如平端连接的效率低和连接速率受末端DNA序列的影响明显，测序过程中产生误差等。这些问题在很大程度上影响了后期的统计分析结果。SAGE方法需要较多的mRNA,因此对于微量样本受到了很大的限制科学家对此方法做了改进健立了多种微量的试验方法,如microSAGE［9］和miniSAGE［10］等。4基因芯片基因芯片是指把大量核酸片段固定在载体基片上，组成密集的按序排列的探针集群，通过与标记样品核酸杂交,杂交信号检测，判断靶核酸的有无或数量的一项技术。常见的芯片可分为两大类:一种是原位合成，适用于寡核苷酸;一种是直接点样，多用于大片段DNA,有时也适用于寡核苷酸，甚至mRNA。基因芯片技术主要包括3个方面的内容:芯片的制备、杂交、检测。基因芯片将半导体工业的微型制造技术与分子生物学技术结合起来，通过把巨大数量的寡核苷酸、cDNA等固定在一块面积极小的硅片、玻片或尼龙膜等基片上而构成。由于该技术同时将大量的探针固定于支持物上，所以可以一次对大量序列进行检测和基因分析，解决了传统的核酸印迹杂交操作复杂、自动化程度低、检测序列数量少等缺点。具有并行性、多样化、微型化、自动化等特点。但其价格昂贵,探针的合成和固定比较复杂，低丰度表达基因不易被检测，还有待于改进提高。目前基因芯片在基因表达分析［11］、医学科研与疾病诊断［12］等各领域得到了广泛的应用。5展望以上几种方法都是目前常用的分离差异表达基因的方法，在技术操作方面都比较成熟，也有许多成功的先例。这几种方法在畜牧兽医领域有着广泛的应用，如对不同发育时期、生理状态或病理过程中基因表达进行分析，能揭示发育过程、生理活动或病理过程的分子机制分离抗病相关基因;寻找病原应答EST£这些ESTs可作为研究机体疾病抗性主效基因的良好候选基因，通过转基因技术可培育出抗病品种;对生产性能不同的动物进行品种间或个体间分析,寻找与生产性相关的差异表达基因，可为分子遗传标记进行育种奠定基础。虽然这几种方法在技术上比较成熟，但都有其各自的优缺点，因此有着不同的应用范围，在试验中要根据实际情况加以利用。为了克服这几种方法的缺点，在不断需求改进的同时，可将其结合使用，来取长补短。例如本实验室将mRNA差异显示技术和微阵列技术结合使用得到了很好的结果。参考文献：LiangP,PardeeAB.DiferentialdisplayofeukaryoticmessengerRNAbymeansofthepolymerasechainreaction[J].Science,1992,257:967-971.LaurenSompayrac,StephenJane,TimothyCBuml,etal.OvercominglimitationsofthemRNAdiferentialdisplaytechnique[J].NucleicAcidsRes,1995,23(22):4738-4739.ShohamNG,AradT,Rosin-AbersfeldR,etal.Differentialdisplayassayandanalysis[J].Biotechniques,1996,20(2):182-184.SturtevantJ.ApplicationsofDifferential-DisplayReverseTranscription-PCRtoMolecularPathogenesisandMedicalMycology[J].ClinMicrobiolRev,2000,13(3):408-427.DiatchenkoL,LauYF,CampbellAP,etal.Suppressionsubtractivehybridization:amethodforgeneratingdifferentiallyregulatedortissuespecificcDNAprobesandlibraries[J].ProcNatlAcadSciUSA,199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