人工种子的研究现状和发展前景

人工种子的研究现状和发展前景白雪11021295411级种工二班引言种子不仅是植物种续代繁衍之本，而且也是人类衣食之源。春种一粒粟，秋收万颗籽。”农业上传统的种植方式，大多是用种子播种来进行作物的繁殖与栽培。植物人工种子的制作，是在植物组织培养基础上发展起来的一项生物技术。“细胞工程技术的开展，为作物的育种与繁殖提供了不少新的技术手段。在离体培养条件下，植物学家们已可使植物的一个芽、一小块茎、一小块叶甚至一个细胞再生成为小植株；在实验室里，一年四季可生产出成千上万的试管植物来。植物人工种子作为一项新兴的生物技术，为农业生产展示了诱人的前景，已引起世界各国的重视。尽管尚未进入应用阶段。但目前植物人工种子技术发展迅速，在不久的将来定能发挥出其潜在的优势。一．人工种子的概念植物人工种子（plantartificialseed）概念最早由Murashige（1978）提出，它是指利用细胞的全能性，将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织（芽、愈伤组织、胚状体等）包埋在含有营养物质和具有保护功能的外壳内形成的在适宜条件下能够能够发育成完整植株的小颗粒。天然的植物种子是由种皮、胚、胚乳三部分组成。种皮是由珠被受精后发育而来，常具有多层细胞：外部为厚壁细胞，内部几层为薄壁细胞，排列紧密，有极强的保护作用和机械力量。胚乳由受精极核发育来，含有大量养料，为胚发育提供营养。胚由受精卵（合子）发育而来，由胚芽、胚轴、胚根、子叶组成，将来发育成新的植株。完整的人工种子包括：人工种皮、人工迄今为止，世界各国约对40种植物的体胚或芽研制过人工种子。我国从1987年开始，正式将人工种子研制纳入国家“863”高技术发展计划。“超级种子”热，为人工种子制作技术的改进及工艺生产流程的建立打下了良好的基础。但这些结果中，除了水稻、生菜等少数几种能较大面积在田间播种以外，大多数仍只是停留于实验室中的工作。一旦要求这一技术由实验室向商业化生产转化，还有不少问题未得到解决。象如何使胚状体发育健壮、大小一致；如何使人工种皮既可通气，又可防止营养物质渗漏及具有防腐、抗压功能，以及如何使人工种子能自动化生产，机械包裹，等等，均是涉及人工种子能否与自然种子竞争而用于生产的重要问题。任何新事物的出现，不可能一开始就十全十美。人工种子研究目前遇到的一些难题，并未冲淡它给农业及其他种植业所展示的诱人前景。随着人工种子研究的日益进展及制作工艺的日臻完善，可以预料，人工种子作为一种新兴的种子产业而用于生产，将是指日可待的事。三．人工种子的应用及意义（一）人工种子的应用1.大田作物(1)水稻：对水稻不定芽进行包埋制作人工种子(2)马铃薯、甘薯：不定芽或者度过休眠期的直径为0.2——0.3cm的微型薯用海藻酸钠进行包埋2.园艺植物：水塔花、胡萝卜3.林木方面：桑树、日本珊瑚树4.药用植物：半夏（二）人工种子的意义1.生产不受自然条件的限制和土地的制约天然种子在农业上受季节的限制，一般一年只能繁殖1-2次。人工种子可在实验室内大量生产不受限制，一个体积为12L的发酵罐在二十天内可生产1000万粒人工种子组织培养苗虽然有许多优点，但成本偏高和运输困难是制约试管苗大面积应用的两个主要因素。与普通的试管苗相比，人工种子具有可自动化批量生产、体积小（通常仅几毫米）便于贮藏和运输、适合机械化播种、发芽和生长发育比较整齐等优点。2.快捷高效的繁殖方式，缩短育种时间一个新的水稻品种用常规方法培育需要七到八年时间，而用人工种子与常规育种结合良种繁育技术减少了已在驯化过程，只需三四年时间。3.人为赋予种子多种优良品质在人工种子制作过程中，可以加入某些农药、有益微生物或生长调节物质，人为的控制植物的生长发育，播种后生长出来的植物就有一定的抗逆性。而且通过转基因技术，可以是立体培养的“胚”具有优良特性。4.固定杂种优势并快速繁殖天然种子是有性繁殖获得的，在遗传上具有因减数分裂引起的遗传重组分离现象。杂种优势只能体现在F1代，而F2代便参差不齐。人工种子属于无性繁殖范畴，可以保持杂种优势。对于一些自然繁殖困难的名贵品种，也可通过人工种子进行快速大量的繁殖。人工种子从本质上说是无性繁殖。因此即使外植体来自杂合体，用它诱导的繁殖体制作出的人工种子，在繁殖出来的植株群体中亦不出现性状分离。由于这一特点，人工种子可用来固定杂种优势，使F1代杂交种可多代利用。优良单株、优良突变体等使用一点植物组织，经培养就可获得大量胚状体，能快速繁殖成无性系，从而大大缩短育种周期、加速良种繁育速度。一个体积为12L的发酵罐在适宜的条件下20d内生产的胡萝卜体细胞可制作1000万粒人工种子，供几十公顷地种植用。人工种子的包裹层是通过化学方法生产的，不存在生物生产的任何限制，一年四季都可在室内生产和扩大繁殖，及时为农业生产提供种源。如果包裹的植物材料是脱毒茎尖，则可获得脱毒苗，从而克服某些植物由于长期进行营养繁殖导致病毒大量积累的现象，并避免脱毒苗在培养过程中重新感染病毒。一些濒危、珍稀植物及宝贵的种质资源，或者自然繁殖有困难的植物，可通过人工种子生产技术得以快速繁殖。四．人工种子的制备技术与流程用体细胞胚包埋制作人工种子流程是由Redenbaugh等人建立起来的。人工种子研制程序大致包括：外植体的选择和消毒；愈伤组织的诱导；体细胞胚的诱导；体细胞胚的同步化；体细胞胚的分选；体细胞胚的包裹（人工胚乳）；包裹外膜；发芽成苗试验；检测体细胞胚变异程度等。（一）胚状体的诱导

生产高质量的胚状体是制作人工种子的关键。从目前的研究结果来看，并不是所有的植物种子都开发出了胚状体培养发生技术。不同植物的体细胞的培养亦有难易。在生产人工种子时，要求胚状体具有可观的成株率，甚至超过天然种子。1．生产高质量的胚状体及其影响因素生产高质量的胚状体是制作人工种子的关键。自从1958年在胡萝卜的组织培养中最先发现胚状体（体细胞胚）以来，诱导出体细胞胚的植物不断增加。但并不是所有的植物都能够发育出胚状体，而且不同植物诱导体细胞胚的难易程度也不同。所谓高质量胚状体，就是要求胚状体具有发育完整、生长健壮及具明显的胚根、胚芽双极性结构；形态学上基本无变异，在无菌试管培养下，胚状体发育比较同步，并能得到较高频率的完整小植株[13]。高质量胚状体的发生受植物基因类型、生物性状等内部因素及许多外界培养条件的共同作用，外部因素主要有：生长激素、碳源、氮源等。不同浓度不同种类的生长激素（6-BA、NAA、2,4-D、ABA、GA3等）在胚状体的发生过程中起到不同程度的调节作用。氮源被认为是胚胎发生的重要因素，氮的种类与用量不但影响体细胞胚的发生，而且对其同步化也有一定的作用。高的无机氮浓度对胡萝卜体细胞胚的发生是必需的。减少氮和硝酸铵的浓度有利于棉花、番木瓜和薯芋胚胎的分化和成熟。而碳源在组织培养中起到维持外植体的渗透压和提供体细胞胚发育所需能源的作用。2．胚状体的诱导胚状体的诱导：胚状体可从悬浮培养的单细胞得到，也可通过试管培养的愈伤组织、花粉或胚囊获得。胚状体一般在培养物的表面产生，其形状与合子胚类似，但胚状体却是无性繁殖的产物。实际操作中，一般在试管中诱导出愈伤组织，并在含生长素的培养液中悬浮培养，然后置于含生长素的发酵罐中，使细胞迅速扩增，再将细胞移入无生长素的发酵罐中诱导出大量胚状体。迄今为止，已在100多种植物中得到了体细胞胚胎，而且在许多珍稀或重要的植物树种上也实现了体细胞胚的正常转株。胚状体是由孢子体或配子体的细胞通过无性繁殖产生的，其形状与合子胚类似，但却是无性繁殖的产物。它的发生方式分直接发生和间接发生2种：直接发生即体细胞胚从原植体不经愈伤组织阶段直接发育而成，其来源细胞可以是外植体表皮、亚表皮、合子胚、花粉等；间接发生即体细胞胚是从愈伤组织、原生质体发育而成。一般在试管中诱导出愈伤组织，并在含生长素的培养液中进行悬浮培养，然后置于含生长素的发酵罐中，使细胞迅速扩增，再将细胞移入无生长素的发酵罐中诱导出大量胚状体。但通过愈伤组织阶段后，胚状体有可能产生无性系变异，产生变异的植株，从而限制了人工种子的应用范围。

3.胚状体同步化处理或分选胚状体的同步化是指促使所有培养的细胞或发育中的细胞团块进入同一个分裂时期。只有同步化了细胞才可能成批地产出成熟胚胎。常用的方法有：

化学方法：饥饿法——将培养基中的一些重要成分反复去除和添加；阻断法——在培养初期加如DNA合成抑制剂，如5-氨基脲嘧啶，阻断细胞分裂的G1期。

物理方法：低温处理法、过滤筛选法、渗透压分离法、密度梯度离心法(体胚不同的发育阶段密度有差异)等到胚状体胎成熟以后，就可以进行人工种子的包埋了。其中过滤筛选法较实用、快速。（二）人工胚乳的制作人工胚乳的制作实质上是将筛选出的适合该体细胞胚萌发的培养基，添加到包埋介质中，以提供胚状体新陈代谢和生长发育所需要的营养物质及生长激素等。人工胚乳一般由基本培养基成分、生长调节剂和碳源组成。在人工胚乳中添加生长激素可提高人工种子的萌发率，但会影响幼苗对环境的适应性。不同的植物对人工胚乳的要求不同,应根据其各自的特点配制不同的人工胚乳。为了满足包裹要求，要有针对性地在包裹剂中加入大量养分、无机盐、有机碳源、植物生长调节剂，以及抗菌素和有益菌类。选用无毒、透气和吸水性强的木薯淀粉与1.5%海藻酸钠(1/2MS培养基配制)混合制作的胚乳可改善单一海藻酸钠人工胚乳的透气性、吸水性和发芽率，人工胚乳中加入GA3有利于人工种子的发芽，加入CaCl2有利于向培养物供氧，提高人工种子发芽率和耐贮藏性，加扩活性炭可改善营养固定和缓释，提高人工种子在土壤中的成苗率。人工种皮的制作自人工种子概念提出后，人工种皮的材料选择和包被技术的改进一直是人工种子研究的热点之一。种皮材料不同，其制作方式也不相同，应根据植物的种类选择适合的种皮材料和制作方式。人工种皮既要求允许内外气体交换通畅，以保持胚状体的活力，又要能防止水分及营养物质的渗漏而起保护作用。一般采用双层膜种皮的结构：内膜和外膜。内膜是人工胚乳的支持物，它必须具备以下特点：（1）对繁殖体无毒、无害，有生物相容性，能支持胚；（2）具有一定透气性、保水性；（3）具有一定强度，能维持胶囊的完整性；（4）能保持营养成分和其它助剂不渗漏；（5）能被某些微生物降解（即选择性生物降解），降解产物对植物和环境无害。内膜可选用几丁质做原料，使之具有较好的通气性；另外，用海藻酸钠做内膜，价格低廉且对胚状体也基本没有伤害，但保水性差，易渗漏。外膜一般选用半疏水性聚合膜，以降低海藻酸钙的亲水性，还可以提高人工种子的保水能力和防止营养渗漏，并可保护人工种子不受土壤中的微生物、温度和pH值变化以及其它生物和物理化学因素的影响，同时也有利于人工种子的运输、贮藏和播种。美国的一个研究组花了近两年时间，从百余种材料中筛选到目前广泛使用的人工种子包埋介质海藻酸钠。这种物质在0.1M氯化钙溶液中可以迅速固化成透明的小胶球。海藻酸价格低廉，质地柔软无毒性，还可人为地在其中加入各种营养物质和生长调节剂，因此是一种，迄今为止已发现的比较理想的体细胞胚包埋剂。美国杜邦公司生产的由乙烯、乙酸和丙烯酸三种物质聚合的Elvax材料是目前认为较好的一种人工种皮材料。人们仍在积极寻找其他的包埋方式和包埋材料，以完善现有人工种皮的制作技术。（四）人工种子的包埋

人工种子的包埋关系到人工种子萌发、贮藏和生产应用等重要环节。Redenbaugh于1984年首次筛选出透水性好的海藻酸钠作为胚状体和不定芽的包埋剂。包埋方法主要有将胚状体或小植株悬浮在一种粘滞的流体胶中直接播入土壤的液胶包埋法；将体细胞胚经干燥后用聚氧乙烯等聚合物进行包埋的干燥包裹法；以及通过离子交换或温度突变形成凝胶包裹材料的水凝胶法，Redenbaugh等用此法包裹单个苜蓿体细胞胚制成了人工种子，离体成株率达86%。组合包埋法以及流体播种、液胶包埋、琼脂、铝胶囊等新颖包埋法也开始被应用，George等用硅胶包埋谷子体细胞胚，葫发率达82%，且4℃贮藏14天后仍能自行裂开、顺利萌发。

对胚状体包裹要求做到：首先，不影响胚状体萌发，并提供其萌发与成苗所需的养分和能量，即起到胚乳的作用；其次，使胚状体经得起生产、贮存、运输及种植过程中的碰撞，并利于播种，即起到种皮的保护作用；最后，针对植物种类和土壤等条件，满足对人工种子的特殊需要。（五）人工种子的贮藏和防腐

1.人工种子的干化人工种子同自然种子一样也需要一定时间的贮藏，但人工种子含水量较大，常温条件下易于萌发，也易于失水，所以人工种子的贮藏技术是其研究的另一个难题。干化能增强人工种子幼苗的活力；有助于贮藏期间细胞结构和膜系统的保持和提高酶的活性，使其具有更高的耐储性。对用海藻酸钙包埋胡萝卜体细胞胚（0.6~2mm）制作的人工种子进行贮藏研究，发现低温及干燥均能在一定程度上抑制人工种子萌发。失水率达67%的种子，2℃贮藏60天后，在发芽培养基上发芽率为100%，7天内的成苗率达80%。未经贮藏的对照种子发芽率为100%，成苗率为76%[14]。Timbert等（1996）研究表明脯氨酸能提高胡萝卜体细胞胚干化的耐受性，延长贮藏时间[15]。2.人工种子的贮藏贮藏是人工种子研究的主要难题之一。目前报道的方法有低温法、干燥法、液体石蜡法、抑制剂法等。干燥法和低温法相结合是目前报道最多的方法，也是人们研究的热点问题之一。低温能有效地抑制发芽，减慢生长速度，但能降低人工种子的活力，对胚有一定的伤害作用。干燥失水能使体细胞胚停滞生长并保持其在贮藏中的活力，但对人工种子的伤害较大，以致复水后幼苗生长势差。低温保藏、干燥处理、ABA处理及减少培养基中的蔗糖浓度等方法常用于人工种子和植物体细胞胚的贮藏。干燥法和低温法组合是目前应用最多的，胡萝卜愈伤组织在15℃相对湿度25%的条件下存放一年仍可再生。大豆体胚干化到原体积的40%～50%后再吸水，萌发率仍达到31%。干化增强人工种子幼苗的活力，可能与其超氧化物酶和过氧化物酶的活性显著提高，从而减轻低温贮藏对体胚的伤害有关。通过电镜观察和电导值与脱氢酶的比较，发现干化有助于体胚贮藏期间细胞结构、膜系统的保持和酶活性的提高，使体胚具有更好的耐贮性。富含胡萝卜体胚的悬浮培养液包埋于水溶性塑料薄膜内，形成的胶囊263.人工种子的防腐研究人工种子的最终目的是为了田间应用。防腐是人工种子贮藏和大面积田间播种的关键技术之一，因此早在1986年Redenbaugh就意识到防止微生物污染的重要性。由于人工胚乳中含有糖类等有机物质，富含营养的人工胚乳一旦暴露于田间，势必会遭微生物的侵染。因此必须采取一定措施使人工种子具备相当的防腐抗菌能力。在人工种子中添加有效成分，加速其萌发，这样能避免烂种及人工胚乳中养分的过度流失，有报道说在胡萝卜人工种子中添加赤霉素（gibberellin，GA）能达到此效果。在甘薯人工种皮中加400～500mg/L的先锋霉素、多菌灵、安苄青霉素或羟基苯酸丙酯，均有不同程度的抑菌作用，萌发率可提高4%10%。但要找到既能抑菌，又对胚无伤害，尤其是不影响胚的正常发育和萌发的防腐剂，还很困难。当人工种子进入大规模田间种植阶段，为了方便操作及降低成本，建议从农药中筛选所用的防腐剂。五.人工种子技术存在的主要问题

尽管目前人工种子技术的实验室研究工作已取得较大进展，并且已在繁殖遗传工程植物、减数分裂不稳定植物、稀有及珍贵植物的过程中，显示出超常的优势。但从总体来看，目前的人工种子还远不能像天然种子那样方便、实用和稳定。主要障碍在于人工种子的质量和成本：(1)许多重要的植物目前还不能靠组织培养快速产生大量的、出苗整齐一致的、高质量的胚状体或不定芽；人工种子的质量达不到植物正常生长、运输和贮藏的要求；人工种子的制种和播种技术尚需进一步研究。(2)目前多数人工种子的成本仍然高于试管苗和天然种子。虽然一些研究机构已经建立起大规模自动化生产线，能够生产出高质量、大小一致、发育同步的人工种子，但是它的成本仍高于天然种子。以苜蓿为例，目前生产1粒人工种子所需成本是0.026美分，而1粒天然苜蓿种子的成本是0.0006美分，二者相差40多倍。因此，人工种子要真正进入商业市场并与自然种子竞争，必须降低生产成本。由于人工种子是由组织培养产生的，需要一定时间才能很好地适应外界环境，因此人工种子在播种到长成自养植株之前的管理也非常重要，在推广之前必须经过农业试验，并对栽培技术及农艺性状进行研究。

由此可见，人工种子要想成为种植业的主导繁殖体，目前仍有相当的困难。

六．人工种子的前景展望人工种子作为建立在体细胞胚发生应用基础研究之上的高新技术，是促进离体快速繁殖，实现田间和温室栽培的重要途径，与现在的试管苗生产相比，人工种子所需用培养基量少、体积小、繁殖快、发芽成苗快、运输及保存方便等优点，对于难结种子，或种子数量少且活力低，又难以用常规的无性繁殖方法进行育苗的珍稀树木，进行人工种子研究很有意义。例如兰科植物种子发芽率极低，现兰花的繁殖都有生产成本高，生产周期长等缺点。如果将人工种子应用到兰科植物的生产中，兰花的生产将更加迅速、优质、低成本。人工种子与试管苗相比，具有所用培养基量少、体积小、繁殖快、发芽成苗快、运输及保存方便的特点；人工种子技术适用于难以保存的种质资源、遗传性状不稳定或育性不佳的珍稀林木的繁殖；人工种子可以克服营养繁殖造成的病毒积累，可以快速繁殖脱毒苗。因此，人工种子在快速繁殖苗木和人工造林方面，具有很大的应用前景。现在，我国处于经济高速发展时期，需要有大量的优良苗木种子供应，而我国现有的林木种子供应远远不能满足社会需求。人工种子可以工厂化地提供绿化种子，解决种子供应量不足的矛盾。随着人工种子技术的不断成熟完善，必将给我国的园林绿化方式带来革命性的变化。人工种子虽有生物技术“明星”、“超级种子”的美称，但人工种子的研究目前仍处于探索阶段，许多问题亟待解决。如高质量、同步化的体细胞胚（或不定芽、腋牙、鳞茎等繁殖体）的发生对许多植物来说还不很普遍；人造胚乳、人工种皮的功能还不及天然种子；人工种子还不能象天然种子那样长时间地保存；播种要求也不能象天然种子那么粗放；人工种子的制作成本偏高等等。虽然人工种子研究热了一阵子后近10年来没有什么大的突破，但人们有信心看到，随着技术的积累和研究的深入，人工种子作为一项新兴的生物技术，其开发利用前景是十分诱人的，这项生物高新技术将在作物遗传育种、良种繁育和栽培等方面起到巨大的推进作用，由此产生的“种子革命”将造福于整个人类。参考文献KittoSL,JanickJ.Handeningtreatmentsincreasesurvivalofsyn-thetically-coatedasexualembryosofcarrot〔J〕.AmSocHortSci，1985，110（2）：283—286.KittoSL,JanickJ.Acitrusembryoassaytoscreenwater-solubleresinsassyntheticseedcoats〔J〕.HortScience,1985,20（1）:98—100.RedenbaughK,PaaschB,etal.Somaticseeds:encapsulayionofa-sexualplantembryos〔J〕.Bio/Technoligy,1986,4:797—801.李修庆.植物人工种子研究〔M〕.北京:北京大学出版社，1990，1-12.MurashigeT.Theimpactofplanttissuecultureonagriculture〔M〕.TheInternationalAssociationforPlantTissueCulture.Canada:UniversityofCalgaryAlberte,1987,15—26.汤绍虎，孙敏.蔬菜人工种子研究〔J〕.园艺学报，1994，21（1）71‖75.唐巍，欧阳藩.马铃薯人工种子的研究〔J〕