微生物实验培养基的制备和消毒灭菌农学

微生物实验培养基的制备和消毒灭菌农学第1页，共18页，2023年，2月20日，星期六（二）原理：培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、生长因子、无机盐和水等营养要素。由于不同微生物细胞组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配制合适的培养基。第2页，共18页，2023年，2月20日，星期六培养基的制备原则：1.根据不同微生物的营养需要配置不同的培养基。2.调配好培养基营养成分的浓度和比例。3.控制微生物的培养条件（渗透压、pH、氧化还原电位等）细菌牛肉膏蛋白胨放线菌高氏1号真菌查氏、马丁氏各类M土豆葡萄糖第3页，共18页，2023年，2月20日，星期六（三）器材：1.药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl、1MNaOH溶液。2.器材：试管、烧杯、量筒、玻璃棒、铁架台、漏斗、天平、牛角匙、高压锅、微波炉、pH试纸（5.5-9.0）、棉花、纱布、线绳、聚丙烯袋等。第4页，共18页，2023年，2月20日，星期六（四）步骤：以固体斜面培养基制作为例：计算称量加热融化调pH过滤（可省略）分装加塞（附棉塞制作）包扎灭菌摆斜面无菌检查第5页，共18页，2023年，2月20日，星期六

1.称量

按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状药品（如牛肉膏），应用烧杯和玻璃棒称量。第6页，共18页，2023年，2月20日，星期六2.配制

向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。如果配制固体培养基，在琼脂熔化时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。一般要求琼脂沸腾3次，完全熔化后，补足所失水分。

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3.调节pH值

培养基溶解均匀后用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1MHCl和1MNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调节。

4.过滤

用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。第8页，共18页，2023年，2月20日，星期六

5.分装

将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分装量如下：

（1）固体斜面培养基：装量为管长的1/5。

（2）液体培养基：装量为管长的1/4。（3）半固体培养基：装载量为管长的1/3。

第9页，共18页，2023年，2月20日，星期六6.灭菌

塞棉塞，包扎，灭菌。培养基做完后，要求在2-4小时内灭菌，否则会被污染。7.摆斜面灭菌完毕，冷却到60℃左右再摆斜面，以免产生过多冷凝水。第10页，共18页，2023年，2月20日，星期六（五）注意事项：1.称量要准确，取药品的角匙不能混用。2.加热融化时要不断搅拌，以免糊底和溢出。（每加热30s看一次）3.蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速。4.培养基中如有微量成分，先配成浓缩溶液后再加入。5.节约药品。第11页，共18页，2023年，2月20日，星期六牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂固体培养基为18g；半固体为10g；液体不加。水1000mlpH7.0-7.2121℃灭菌20min第12页，共18页，2023年，2月20日，星期六棉塞制作第13页，共18页，2023年，2月20日，星期六二、消毒灭菌：物理法：加热、过滤、照射化学法：化学药品灼烧干热湿热加热高压间歇煮沸第14页，共18页，2023年，2月20日，星期六原理：加热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质变性达到灭菌的目的。干热：160-170°C1.5-2h湿热：121.3°C15-30min紫外线灭菌是诱导胸腺嘧啶二聚体的形成，而抑制了DNA的复制。另外，电离过程中生成的O3和H2O2均有杀菌作用。适用范围湿热主要用于各类培养基及液体物质干热主要用于玻璃、金属等器皿、工具紫外线主要用于接种箱、无菌室内空气及物体表面灭菌第15页，共18页，2023年，2月20日，星期六操作步骤：1.湿热灭菌（高压蒸汽）向锅内加入适量的水装待灭菌物品加盖

加热排冷空气升压、升温维持所需温度20-30min降压、降温开盖取物趁热摆斜面第16页，共18页，2023年，2月20日，星期六2.干热灭菌（干燥箱）将待灭菌物品包好装入待灭菌物品升温

恒温降温（70℃以下）开箱取物

3.紫外线灭菌（接种箱或无菌室内）放入待灭菌物品甲醛（酒精）熏蒸开紫外线灯（30min）关灯工作第17页，共18页，2023年，2月20日，星期六注意事项：1.高压灭菌：切勿脱水工作，排净冷空气，工作人员不能远离，当压力降到“0”时