心血管疾病药效学研究专家讲座

缺血性心脏病

(心绞痛、心肌梗死)药心血管疾病药效学研究第1页一、试验设计医学基础依据缺血性心脏病(心绞痛、急性心肌梗死)主要症状发觉，中医将其归属于“厥心痛”、“真心痛”、“胸痹”范围。病位以心肾为主。基本病机为本虚标实。本虚以脏气亏虚为主．可兼阴虚；标实以血瘀痰阻多见，可兼气滞、寒凝。基本治法为宣痹通阳，活血化瘀，芳香温通及扶正固本。缺血性心脏病可由不一样病因引发，最常见原因是冠状动脉粥样硬化、冠状动脉血栓及冠状动脉痉挛。其共同特点是因为心肌供血不足所致氧供需矛盾而发生一系列病理生理改变及证候。改进心脏血管功效，增加心肌供血供氧，降低氧消耗，改进心肌代谢，缓解心绞痛，减小心肌梗死面积是药品治疗主要目标。二、药效学研究试验设计缺血性心脏病需要进行药效学试验较多，—般应以整体动物试验为基础，依据药品特点及试验要求适当选取器官、组织、细胞及分子水平试验，多层次试验相结合，有利于重复验证和说明作用原理。但因为缺血性心肌发病机制复杂，防治路径，方法及药品类型亦较复杂。应明确研究思绪，作用路径，选择适宜主要药效学试验方法及必要观察指标，进行止确分析判断，以求得科学结论。心血管疾病药效学研究第2页

(一)对心肌缺血心肌梗死防治作用试验1．惯用动物模型(1)冠状动脉阻断或缩窄形成心肌缺血和心肌梗死模型：经过阻断或缩窄冠状动脉方法，如结扎、电刺激、气囊法，血管内异物法及注入凝血酶或ADP法等。(2)药品诱发心肌缺血模型：经过药品诱发冠脉痉挛法，如垂体后叶素、麦角新碱，以及经过增加心肌耗氧法，如异丙肾亡腺素等。(3)离体试验心肌缺血模型：结扎离体心脏冠状动脉法、离体心脏低氧或无氧灌流法。(4)体外培养心肌细胞缺血样损伤模型：控制心肌细胞供氧和培养基中含糖量，形成“缺血样损伤”模型。(5)心肌缺血冉灌注损伤模型：整体动物心脏缺血再灌注损伤．离体心脏和心肌细胞缺氧缺糖再灌注损伤等模型。以上心肌缺血模型第一项可用于急性和慢性心肌缺血试验，可观察药品药理作用、起效及作用时间等。其余均为急性心肌缺血模型，可作药品作用机制分析研究。心血管疾病药效学研究第3页2．观察指标(1)直接测定心肌梗死范围：①大致标本活体染色法，以定量组织学(N—BI'染色或TIC染色或双重染色)观察心肌梗死面积改变。②病理切片显微镜检验，镜下观察心肌病变程度和范围。③病理切片荧光摄影法，利用四环素能与心肌坏死细胞中钙整合特征，在切片上进行荧光摄影，以测定梗死面积。④电子显微镜观察细胞膜、线粒体、内质网、细胞核及染色质等心肌细胞超微结构改变。(2)间接测定心肌梗死范围：①心外膜电图标测法，阻断或缩窄冠状动脉形成心肌缺血及心肌梗死，以多点心外膜电图标测心肌缺血程度和范围改变。②酶学指标观察，测定血中磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)等与心肌损伤相关酶类改变，动态观察心肌损伤情况，定量分析心肌损伤程度。③核示踪法，将肘心肌坏死有亲和力物质进行核索标识来观察梗死情况，惯用有锝—四环素和锝—焦磷酸亚锡。

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(3)缺血区测定指标：①染料及荧光素法，经过从冠脉注入染料或荧光素，然后进行肌切片观察心脏血流灌注情况，从而计算无染料(或荧光)面积(即缺血面积)，如合并应用N—BT做活体双重染色法可计算梗死面积与缺血面积比值。②核示踪法，利用放射核铊依靠钠泵进行转运而不能进入缺血或坏死细胞特点，经过闪烁摄影来观察心肌缺血部位及范围。③放射自显影法观察缺血区。④心表面荧光法，用表面荧光摄影来分析缺血K情况。⑤冠脉血流量、冠脉返流量及返流压测定。⑥心肌区域血流量测定。(4)其它可供分析指标：心肌代谢指标，如心肌氧代谢，其它物质及能量代谢，如FFA、ATP、PGI2、TXA2、cAMP/cGMP，SOD、MDA、乳酸、钾、钙、镁离子、血凝状态及血液流变性等。心血管疾病药效学研究第5页

3．方法学评价以上各项试验方法中，以阻断动物冠状动脉所致之不足心肌缺血是当前国内外应用最广泛方法，经过狭窄或完全闭塞冠状动脉，使其供给区血流降低或缺无，造成心肌缺血，心肌因缺血、缺氧而发生代谢紊乱，以致发生凝固性坏死，其发病过程和机制与临床相同，与中医理论“瘀血证”有一定联络，较为合理、实用。可依据所试药品功效、主治和作用特点选取上述形态、电生理、生化、放免、核示踪、荧光等观察指标与方法，能够定位、定性、定量观察缺血心肌动态改变及药品影响，较为准确评价药效。应作为新药主要药效学首选试验。心血管疾病药效学研究第6页(二)对心脏血流动力学及心肌耗氧量影响试验1．试验动物与观察指标(1)犬心功效及血流动力学试验：观察指标应包含心电图、心率。动脉血压、冠脉流量，冠脉阻力、心输出量、心肌收缩力、左室做功、左室内压、左室内压最大上升速率、心搏出量、心脏指数、心搏指数、总外周阻力等，并可同时测定心肌耗氧量、氧利用率、耗氧指数等。(2)猫、鼠等其它动物心功效及血流动力学试验：观察指标应包含心电图、心率，动脉血压、心输出量、左室内压、左室内压最大上升速率、中心静脉压、左室别血张力指数、左室作功指数、心脏指数、左室舒张未期压等。(3)无创性心功效检验：如超声心动图、阻抗图、Y—摄影等。2．方法学评价心脏血流动力学、心肌耗氧量等应作为评阶药品作用及作用机制主要指标，对于了解药品对心肌功效、血管顺应性、心肌供血及心肌氧代谢影响，结合对心肌缺血、心肌梗死等指标影响，作综合性评价有主要意义。心血管疾病药效学研究第7页(三)其它试验1．血小板聚集性试验血小板聚集性增强是造成血液循环障碍造成心肌缺血发生主要原因之一。药品对动物血小板聚集性影响可作为药效学研究辅助指标。试验动物用兔或大鼠。以三磷酸腺秆、花生四烯酸(AA)、胶原、凝血酶等作为绣导剂，应用比浊法或其它方法测定。2．血栓形成及溶栓试验冠状动脉血栓形成是直接造成心肌缺血原因之一。对血栓形成影响和溶栓作用应为评价治疗心肌缺血药品药效辅助指标。惯用免或大鼠以Chmldlcr血栓形成法，测定心栓重量及长度；应用大鼠以动—静脉旁路法测定血栓湿重；电刺激人鼠颈总动脉形成动脉血栓，用以观察药品对体内血栓形成时间影响;电刺激犬或猪冠状动脉形成冠状动脉血栓，以心肌缺血程度范围、心肌梗死、心肌酶及冠脉血栓占管腔百分比等多项指标综合观察药品对心肌缺血防治作用和溶栓作用。

心血管疾病药效学研究第8页3．血液流变学试验心肌缺血发生前后，常伴有血液流变学改变。所以，测定血液黏度、血浆纤维蛋白原含量、血细胞比容、红细胞沉降、血小板黏附和聚集等血液流变学指标，对评价药品作用有主要意义。4．氧代谢试验增加心肌供氧和提升心肌耐缺氧能力，改进心肌能量代谢是药品治疗缺血心脏病主要作用。方法除前面介绍心肌耗氧量测定外，可同时选取小鼠常压、低压耐缺氧等试验和指标。心血管疾病药效学研究第9页(四)阳性对照药阳性对照药既可选择西药，也可选中药。西药作用明确，疗效必定，尤其是一些经典药品，可检验试验方法可靠性。西药剂量与中药量相差较大，作用特点亦不大相同，不做药效强度比较。采取中药阳性药时，一股应选疗效必定功效主治相同中成药对照，对照药应是药典记载或经卫生部同意生产；对照药剂应与受试药等效或相当，方便进行比较，同一受试药不一样药效学试验选取不一样阳性对照药。心血管疾病药效学研究第10页

三、动物模型建立方法(一)犬或小型猪心肌缺血及心肌梗死模型1．原理经过缩窄或完全闭塞冠状动脉，降低或停顿供给区血流，形成心肌缺血、缺氧而发生代谢紊乱，以致发生心肌坏死。2．方法健康成年犬或小猪(现我国已培育出试验用“中国试验小型猪”)，雌雄兼用，体重10—15kg，经戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉，手术台固定，分离气骨并插管，连接电动呼吸机，调整潮气量300—600wi，动脉氧分压维持在12—13kPa(90-100mmHg)，血pH在正常范围；左侧第四肋间开胸，暴露心脏，剪开心包，做心包床；分离冠状动脉左前降支中段(普通相当厂第三分支根部)，可用以下儿种方法阻断冠状动脉，形成心肌缺血：(1)冠状动脉结扎法：在冠脉分离处穿3—4号处线以备结扎，或用动脉夹阻断，普通用于急性心肌缺血试验。(2)冠状动脉血栓形成法：将弧型针状电极(刺激电极)置于分离冠状动脉下，另一电极(参考电极)距刺激电极o．6mm处置于心外膜下，两电极分别连接电刺激仪隔离器正负极，以2．5、lmA直流电刺激冠状动脉30min左右，冠状动脉内血栓形成，阻断冠状动脉血流，诱发心肌缺血。心血管疾病药效学研究第11页(3)冠状动脉气囊压迫法：压迫环由有机玻璃外套和可膨胀乳胶小囊组成，外套长5mm侧面lmm缝隙，血管由此进入肺内，小囊长3—4mm，一端密闭，一端与塑料管相连，充满蒸馏水或生理盐水，经塑料管注水30—40ul使小囊膨胀以压迫套内血管，当压力去除时，小囊恢复原状，冠状动脉重新通畅，适合用于急性和慢性心肌缺血或再灌试验。(4)Ameroid缩窄环法：为形成慢性冠状动脉闭塞、心肌缺血或观察冠状动脉侧支循环改变，用含有吸水性塑料环(Ameroid环)套在冠状动脉左旋支根部。关闭胸腔后，塑料环吸收组织水分膨胀，环外壳系硬质材料做成，限制环外展，结果压迫冠状动脉，形成心肌缺血。环植人4—6星期，血骨内径缩小80％-90％。(5)清醒动物心肌缺血试验：将气囊压迫环固定在冠状动脉适当部位，缝合心包，放置心包膜电极，气囊导管电极导线分别穿过胸壁引出皮外，逐层缝闭胸。试验时注入蒸馏水，使气囊膨胀，压迫冠状动脉造成心肌缺血，测量心外膜电图或其它观察指标,本法可重复阻断冠状动脉，进行屡次清醒动物心肌缺血试验及再灌注损伤试验。(6)缺血再灌注创伤：在心肌缺血一定时间造成心肌损伤后，冉供血一定时间，加重心肌损伤而形成再灌注损伤，观察药品保护作用。心血管疾病药效学研究第12页3．药品疗效判断(1)心外膜电图标测：心外膜标测点定位应包含缺血中心区、边缘区和非缺血区，标测方法：将心电极固定于含有一定弹性无刺激性材料作成片子上，该片四角缝于心外膜，如多点固定式心外膜电极。或直接将每个电极固定于心外膜表面，或用一个灯芯电极按次序点测标测点。或用一个电极沿心表山一定路径移，记出一个连续心外膜电曲线。电极用浸泡生理盐水烛芯棉线或细毛笔尖等柔软材料探查电极，联于心电图胸前导联描记，用普通心电图机或多导生理统计仪统计。确定心肌缺血以ST段抬高作为指标，以ST段抬高≥2mv点数(N—ST)代表心肌缺血范围，以各点段抬高毫伏数之和(∑—ST)代表心肌缺血程度。统计阻断冠脉血流前后改变及药品影响。

心血管疾病药效学研究第13页(2)缺血区及梗死区面积测定：在阻断冠状动脉血流孔后，经左心耳根部向心房注人碳索墨水1．5ml／kg，20-30s注完，快速取下心脏，冰冻30—40min，在冠状动脉结扎线下．平行冠状沟等厚度将心室部分横切成5片，分别称重，再用求积仪或电脑图分析仪测量每片心肌两面墨水染色区与末染区(缺血区)，计算心肌缺血范围重量及百分比。然后将5片心肌置硝基四氮唑蓝(N—BT)染液中，震摇染色15min后取出，正常心肌染为暗蓝色，梗死区心肌则小着色或浅黄色，用求积仪或落点求积法或电脑图像分析法测量每片心肌两面梗死区和非梗死区，计算出每片心肌总面积、总重量；缺血区和梗死面积和重量；计算缺血区占心室百分比，梗死区占心空白分比，及梗死区占缺血区百分比，以评价药品疗效。心血管疾病药效学研究第14页

(3)生化指标：阻断冠状动脉前后定时抽取血液，测量血中乳酸脱氢酶改变，分析心肌损伤情况。为防止具他肌肉组织释放酶干扰，测同工酶。同时可测定血ATP、cAMP／cGMP、无机离子、代谢物、能量代谢物质等，如需了解药品作用与前列腺素关系，可观察PGl2或代谢产物改变，以观察药品正确影响。如需了解药品与氧自由基关系，可测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)作为氧自由基产生和去除观察指标。(4)血液流变性指标测定：阻断冠状动脉前后定时抽取血液，测定全血黏度、血浆纤维蛋白原含量、血细胞比容、红细胞沉降率、血小板黏附和聚集性等血液流变学指标。心血管疾病药效学研究第15页4注意点犬和小型猪是建立心肌缺血模型最惯用动物，其体积大小适中，性情温顺、易训练、心脏解剖及生理特点与人相同，其影响原因有：(1)动物冠状动脉分支及侧支循环有个体差异，对分支及侧支变异大，不合标准应剔除不用，各组动物模型心肌缺血程度和范围靠近。(2)正式试验之前应熟练掌握动物开胸手术和冠状动脉分离手术，尽可能降低出血，做心包床时，心肌不应移位而影响心脏正常舒缩功效。(3)试验时应严格控制心外膜电极位置、压力，心脏表面温度、湿度及位置。心外膜电极放置位置，或重复测定位置应准确固定，不应移位。电极不可对心脏压力过大，心脏表面温度及湿度应稳定，不可干燥。不然将影响试验准确性。(4)试验可注射给药，但口服中药消化道给药，消化道灌胃给药或十二指肠给药，灌胃时，注意动物提前8—12h禁食。(5)在进行本项试验时一定要严格控制试验条件，排除干扰原因，确保试验结果。必要时同时测血氧、pH等。

心血管疾病药效学研究第16页(二)大鼠试验性心肌梗死模型I，原理结扎大鼠冠状动脉前降支，阻断其分布区域心肌供血，心肌细胞长时间缺血缺氧而造成不可逆损伤和坏死。2．方法取体重200—250g雄性大鼠，乙醚吸入或戊巴比妥钠腹腔麻醉，仰卧固定，气管插管，在胸骨侧作2cm纵切口，近胸骨侧剪断第三第四肋软骨，打开胸腔，联接呼吸机(通气量2ml／l00g，50次／min)。剪开心包膜，暴露心脏，冠状动脉左前降根部穿线以备结扎，统计标准导联心电图，稳定10min，结扎冠状动脉左前降支，关闭胸腔，用针筒或橡皮吸引吸出动物喉部分泌物，使动物恢复呼吸。心血管疾病药效学研究第17页3测定指标(1)心电图ST段及Q波标测：统计标准导联心电图及胸前导联心电图，测∑—ST、病理性Q波、严重心律失常等指标。(2)测定血浆生化指标：如IDH、CPK、ATP、cAMP／cGMP、PGI2／TXA2等。(3)梗死面积估算：处死动物，取心脏横切数片，测梗死面积，方法同前，但误差较大。可用石蚶包坤组织块切片，染色，显微镜下观察，分级定度或用定量组织学方法直接算心肌梗死面积。4．注意点本试验方法在普通试验室条件均可进行，方法简便，但动物较小，操作不便，耐受缺氧时间不长，心脏较小，试验误差较大，可作为辅助试验。手术者必须熟悉冠状动脉分布和解削位置，便于定位。操作者严格训练．操作熟练，手术时间不宜过长，部分结扎冠状动脉后ECG无改变者需剔除。

心血管疾病药效学研究第18页(三)心肌缺血再灌注损伤模型1．原理心肌经一定时间缺血(缺氧)后，突然恢复血(氧)供，形成更严重损伤，即“心肌缺血再灌注损伤”，其形成原因可能是心肌恢复血流时，加速细胞膜内外钠钙交换，大量钙离子进人细胞内，形成“钙超载”：心肌细胞发生“拘缩”而丧失功效。心肌缺血再灌注损伤模型既可用于整体动物，又能用于离体心脏和体外培养心肌细胞。在药效学研究可依据所试药品药理作用及作用特点，选取不一样动物和模型。2方法(1)在体心脏心肌缺血再灌注损伤模型：试验可用各种动物如，犬、小型猪、猫和大鼠等。普通采取阻断局部冠状动脉血流一定时间，然后恢复冠脉血流，形成再灌注损伤。手术方法观察指标大致同前。心血管疾病药效学研究第19页

(2)离体心脏缺血再灌注损伤模型：试验普通用成年Wistar种雄性大鼠，猛击动物头部使昏迷，快速开胸，摘取心脏、马上放人4℃改良Krebs-Hensleit液中，主动脉插管，装于Leaigendorff罐流装置，以K—H液(pH7．4)恒温37℃进行灌流。将两电极分别于主动脉及左心室壁，统计心表面电图。试验程序：①预备灌流期，心脏正常灌流(正常改良K—H液)，稳定l0min，给药灌流(含不一样药品改良K-H液，试验连续进行)5min。②缺血期，以00号线于左心耳部下力进针，从肺动脉圆锥旁穿出，结扎冠状动脉10min。③复灌期，剪断结扎线，进行再灌注15min。

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3观察指标①心表面电图，统计复灌后5min出现室性早搏PVC个数对数值lgPVC及室速与室颤总时对数值。②心肌丙醛(ADA)含量及越氧化物歧化酶(s0D)活性，试验结束后，剪下再灌区全层心肌约0．2g，制备匀浆进行测定。③心肌离子含量测定，试验结束后，以无钙冲洗液(三羟甲基氨基甲烷缓冲掖)冲洗心肌，取再灌区层心肌约o2g，干燥至恒重，以硝酸消化溶解，无离子水稀释至所需浓度，原子吸收分光光度汁或等离子休发射光谱仪测定钠，钾、钙，镁等离子含量。心肌梗死面积测定，试验结束时，将心脏横切染色，计算心肌梗死面积。心血管疾病药效学研究第21页

(四)体外培养心肌细胞缺血样损伤模型1．原理通常应用Wistar种大鼠乳鼠进行原代心肌细胞培养，用缺氧缺糖形成缺血样损伤。心肌细胞缺氧缺糖后，功效从形态有显著改变，如胞浆泡形成，胞浆颗粒增加出现异形心肌细胞等；经活体染色证实细胞死亡数增加；搏动频率下降，动作电位改变；胞浆乳酸脱氢酶，羟酸脱氢酶及磷酸肌酸肌酶大量漏出等、可利用这些指标评定药品对心肌细胞缺血样损伤保护作用。心血管疾病药效学研究第22页2．方法取出生2—3曰乳鼠，开胸、取心室，放人盛有Eagle培养皿中，重复冲洗3次，三角烧瓶中用眼科剪将心室组织剪成碎块，加入0．06％胰蛋白酶溶液。在搅拌器上37℃水浴消化10min．自然沉淀后，丢上消液，沉淀组织块再加入胰蛋白酶，消化l0min，然后吹打1min，自然沉淀，上清移人离心骨中。加入等量冷培养基以终止消化，离10min(r／min)，弃上清，再加入适量培养基于离心管内细胞沉淀中，混匀，离心，弃上清以洗残余胰蛋白酶，加入15％Eagle培养基，制成细胞悬液。将自然沉淀组织块重复消化数次，直至完全分散为止。将各次消化制细胞悬液集中，制成心肌细胞悬液，接种至玻璃培养瓶，塞紧，37c下静置单层培养或在二氧化碳培养鞘开放培养。体外培养心肌细胞缺氧缺糖性损伤模型建立方法：取培养3日心肌细胞，按下法进行缺氧缺糖试验．①缺糖：试验时采取无糖液或不含糖Eagle培养基代替正常培养。②缺氧：将无糖Hanks液或无糖培养基预先用纯氮气(99.999％)饱和15min；试验时换人这种缺氧缺糖液或培养基，培养瓶内再充人氮气(1l/min)30s．以置换瓶内空气，然后塞紧瓶塞。正常对照组用正常Hanks液或培养基，不充氮气，如用二氧化碳培养箱加以培养，则通人95％N2+5％C02气体形成缺氧。也可在缺氧后再供氧，形成冉供氧损伤，开观察药品对供氧损伤影响。心血管疾病药效学研究第23页

3．测定指标(1)形态学观察：用台盼兰染色进行死活细胞判定，观察细胞活力改变及死亡百分比，光学显微镜下可观察心肌细胞形态改变，如伪足改变、胞泡形成、胞浆颗粒增加、异形(长形、纺锤形)心肌细胞出现。在扫描或透射电镜下观察超微结构改变。(2)心肌细胞搏动改变：包含搏动频率、节律及强度等。(3)胞浆酶释放：可用生化或细胞化学方法测定缺氧缺糖后心肌细胞内从培养基中酶改变，如IDH、CPK、羟酸脱敏酶、转氨酶等改变。(4)其它：测定细胞内氧化物歧化酶改变从钙离子运转等。上述观察指标综合选取，以判断心肌细胞损伤程度及药品保护作用。心血管疾病药效学研究第24页

4．方法学评价优点：①观察药品对心肌细胞直接作用，可排除药品经过其它间接影响心肌缺血氧作用。②节约药品，适合用于分离或合成得到极少药品进行试验。③适合用于从细胞或分子水平进行机制研究。不足：①技术设备要求高。②不适于观察不溶于水或含杂质粗制药品，或非直接作专心肌细胞药品作用。所以，本法应与整体或器官水平试验配合进行，方便更全方面判断药效。心血管疾病药效学研究第25页(五)药品诱发心肌缺血模型近年研究认为冠状动脉痉挛是造成心肌急性缺血主要原因之—．致心绞痛、心肌梗死和猝死。当前惯用垂体后叶素在整体动物(犬、小型猪、兔、豚鼠，大鼠)或离体心脏上造成冠脉痉挛心肌缺血模型，或用儿茶酚胺类药品引发心肌缺血方法，以评价抗心肌缺血药品疗效。l、垂体后叶素诱发心肌缺血模型(1)原理：垂体后叶素能使冠状动脉痉挛，造成急性心肌供血不足，从外周阻力增加．造成心脏负荷加重，心电图可见心肌缺血经典改变，适合用于缓解冠状动脉痉挛以防治心肌缺血药品初筛方法；垂体后叶素能收缩全身(尤其是内脏)小血管，作用是非特异。心血管疾病药效学研究第26页(2)方法：大鼠缺血模型：取体重200g健康大鼠，腹腔注射乌拉坦麻醉，仰卧固定，将电极插入四肢及胸前心尖搏动处皮下，调整心电图灵敏度1mV=15mm，纸速为50mm/s，可琏接心电示波器连续观察心电改变，统计胸前导联或导联心电图。试验前有心电图或心律失常异常改变，则弃去不用，依据所试药品特点选择适当给药路径和间隔，静脉给后1—5min腹腔注射后15—30min，灌胃后1-2h，经下静脉或尾静脉注射垂体后叶素0．5或0．7u／kg，注射速度5s或l0s。注射后即刻、5s、10s、15s及30s、lmin、2min及5min，重复统计心电图(统计时间可据示波器所表示异常情况决定)。正常大鼠注射脑垂体后叶素后心电图改变分两期：第一期，注射即刻至30s，T波升高，ST段抬高(超出o．1mV)，尤以l0s改变最显著。第二期，注射后30s至数分钟，T波低．双相、倒置，心率变慢，P—R及Q—T间期延长。判定标准，以出现第一期或第二期缺血改变为阳性，不然为阴性，比较各组差异，并做统计学处理。

心血管疾病药效学研究第27页家兔缺血模型：健康家兔，体重2—3kg，在清醒或麻醉状态下进行试验，统计胸前导联或D导联心电图，耳静脉30s注入垂休后叶素2．5u／kg，心肌缺血心电改变急剧，不便判断药效，亦可改用静脉滴注法，即在l0min内恒速滴人上述剂量垂体后叶素，心电图改变可连续到15—30min，除上述缺血性心电图改变外，偶有窦性心律失常、室性早搏、室性心动过速等心律失常发生。判定指标同大鼠。心血管疾病药效学研究第28页

2，异丙肾上腺素诱发心肌缺血模型(1)原理：异丙肾上腺素为受体兴奋剂．经过加紧心率增加心肌收缩力等步骤，增加心肌耗氧量，造成心脏负荷过重，心肌微循环障碍，连续应用可形成心肌损伤，可专心电图和病理方法观察病变程度。适用调整心肌代谢、氧供需平衡及作用于受体药品研究；(2)方法：健康大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、猫或犬均可。经心电图检验，弃去心电图有异常改变或心律失常。大鼠、豚鼠和犬每日皮下注射异丙肾上腺素2—8mg／kg，家兔10—16mg/kg连续两日，第一次和第二次绐异丙肾上腺素后30min内，每隔5min统计心电图一次，第二次给药后24h统计心电图后杀死动物，取心脏做病理切片检验。心血管疾病药效学研究第29页异丙肾上腺素可引发T波倒置或双相，有ST段抬高，窦性心动过速(心率显著加紧)，早搏或伴有其它心律失常。心肌病理观察可见：白细胞和巨噬细胞浸润，心肌纤维肿胀、断裂、横纹消失、甚至溶解，发生玻璃样变和脂肪变性等。比较各心电图和病理改变，以判断药效。(3)注意点：适合用于研究影响心肌氧代谢平衡或作用受体而防治心肌缺血药品，专心电图难于定量观察药品作用，须用病理观察，但制备病理标本及观察量较大，难准确定量，是其缺点，可用分级定度或半定量法观察。心血管疾病药效学研究第30页

3．麦角新碱诱发心肌缺血模型(1)原理：动物左冠状动脉干注入麦角新碱，可诱创造显冠状动脉痉挛和血流动力学改变：平均动脉压、冠脉压和肺动脉压及外周阻力增加，心排出量下降，乙电图ST-T抬高，60％发生室性心律失常，左冠状动脉造影显示狭窄率达50％—75％，动脉血氧下降，血小板聚集和血拴烷增加，前列腺环素下降，显示急性心肌缺血缺氧全身高凝状态病理生理改变：、病理学证实，心肌有缺血坏死性改变及冠脉血栓形成。这种动物模型可用以评价经过缓解冠状动脉痉挛、攻善血液流变性等各种路径．防治心肌缺血药品。(2)方法：健康犬，体重lo—20kg，戊巴比妥钠30mg／kg注射麻酢，自右侧股动脉插入导管至左冠脉主干，以麦角新碱o.22mg／kg于生理盐水，lmin内拄入，可形成冠脉痉挛及心肌缺血。(3)观察指标：心电图或体表标测心电图∑—ST及N—ST改变。血流动力学改变。生化指标：CPK、血小板聚集、TXB2、kelo—PGF等改变。心脏病理学改变。(4)注意事项：本试验特点是不开胸，不结扎冠状动脉，经过心电图、血流动力学、生化和病理研究以评价抗心肌缺血药治疗作用。但设备及技术要求较高，如血流动力学测定需要带热敏电阻Swan-Gmlg四腔导管等。为简化试验方法，可试用猫、兔、大鼠或豚鼠按照垂体后叶素试验方法进行。心血管疾病药效学研究第31页(六)心脏血流动力学试验1．原理心肌缺血往往伴随心脏血流动力学改变，人部分治疗缺血性心脏病有效药物均可改进血流动力学而发挥作用。所以，心脏血流动力学指标应作为主要药效学研究内容。试验动物可用犬、小型楮、猫或大鼠，但后两种动物心脏较小，一些指标不宜直接观测，犬和小型猪应作为首选动物。2．方法健康犬或小型堵，雌雄兼用，体重12-15kg试验动物用戊巴比妥钠(30mg／kg)静脉麻酐，手术台固定，分离气管并插管，连接电动呼吸机，调整潮气量300—600ml，动脉氧分压维持在如—100mmHg，血ph在正常范围；左侧第四肋开胸，露心脏，剪开心包，做心包床：分离冠状动脉左旋及主动脉根部。放置对应直径电磁量计探头，分别测量冠脉血流量及心出量。左心室尖部插管，连接压力换能器，测定左室内压，再经微分恻定左室内压上升最大速率。颈外静脉插管至冠状静脉窦，动脉插管，以血氧测定仪或血气分析仪分别测定冠状静脉血氧含量及动脉血氧含量，计算心肌耗氧量。股动脉插管测定动脉血压，以肢体导联观察标准导心电图并计算心率。公式算其它血流动力学指标：心搏出量、耗氧指数、心脏指数、冠脉阻力外周阻力及氧利用率等。将上述各项指标同时录于多道生理统计仪。3.注意点本试验难度较大，耍具备成套精密仪器。、试验人员要经过严格训练，尽可能降低对心肌功效影响。分离主动脉根部、冠状动脉及对应电磁换能器、心尖部插管等是手术成功关键。

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(七)冠脉循环试验1．原理冠脉流量是评价防治心肌缺血药品主要指标。多年来，国内外对扩张冠状动脉药品进行广泛、系统、深入研究：，即使能增加冠脉血流量药品很多，但不一定都有防治心肌缺血作用。研究中，应以各种指标综合分析，了解平衡两方面改变，尤其是净效应，才能取得准确结论。冠脉流量测定分两种：即整体冠脉流量测定和离体冠脉流量测定。为了解药品对缺血区心肌实际供血情况，可在整体试验动物中进行冠脉侧支循环、心肌区域血流量、心肌营养血流研究，从不一样角度反应药品对冠脉循环影响及防治心肌缺血疗效。心血管疾病药效学研究第33页2．方法(1)犬冠脉循环试验法：冠脉血流量测定，手术方法与步骤同心脏血流动力学试验。试验动物开胸完成后，分离冠状动脉左旋支，放置适宜电磁流量探头，测量冠脉血流量．测定动脉血压。试验结束后，取下心脏称重，以1／3心重作为冠脉旋支血流供血区域，计算每100g心肌每lmin血流量。冠脉侧支循环研究方法：试验用健康成年犬，手术同前，开胸手术完成后，分离上动脉根部。放对应直径电磁流量计探头．测量心输出量。在冠脉左前降支下1／3处，分离并结扎冠状动脉，于远端插入冠脉插管。分离颈总动脉插管，与冠脉插管相连形成旁路，灌注前降支远端。三通第三臂接橡皮臂，以搜集反流量，测量反流压。插前，静脉注入肝素750u／kg。分离股动脉，插入动脉管，统计动脉血压。试验开始，阻断须总动脉向冠脉左前支灌流。停灌后10min，分别统计心输出量、冠脉反流量及反流压，动脉压及心率，作为给药前对照值，然后给予试验药品。给药后不一样时间，分别纪录各值，反流量推算单位压力差下冠脉恻支血管流量(CVC)=反流量／动脉舒张压，以此反应侧支血流阻力改变。心血管疾病药效学研究第34页(2)冠状静脉窦血流量测定：经过测量冠状静脉窦血流量，反应冠脉血流量改变，约60％冠脉血经冠脉窦流入右心房。利用冠状静脉窦插管直接抽血测定血氧含量，计算出心肌耗氧量及氧摄取率。注意事项：本法研究药品对犬或猫冠状静脉窦流出量、心肌耗氧量影响，简单方便，作为初筛抗心绞痛药品，能从供血与耗氧两力面来评价。心血管疾病药效学研究第35页(3)Rb测定心肌营养血流量：冠脉血流除了经过毛细血管为心肌提供营养性血流外，一部分血流经动—静脉吻合支分流人静脉，二者组成冠脉总血流量。为寻找治疗冠心病药品，观察心肌营养性血流量及冠脉总血流二者配合更有意义。铷与钾为同族元素，理化性质相同，均可经过血流进入心肌胞，血流越大，撮取量越多。Rb半衰期为19．5日，易于测定，对心肌有特殊亲和力，摄取量为骨骼肌2，5倍，故适合用于测定心肌营养血流量。方法：取体重24g健康小鼠分组，给药或对照药后隔一定时间，依据待试药品药代动力学过程确定，从尾静脉注射RbCl生理盐水溶液o．1ml(4000—10000脉冲／min)，5s注入，注射后30s，马上处死动物，取心脏，用生理盐水冲洗4次，每次l0ml。然后将心脏置玻璃研钵内．磨成匀浆，放特制铝箔小皿内，在普通灯下烘干，用射线自动标器计数。以每个心脏放射性占注入总放射性分数为指标，观察小鼠心肌摄取Rb量多少。注意：①为防污染，全部操作在盘内进行．试验后一并处理。②Rb量及动物处死时间要准确，井将心脏动静脉全部剪掉。③每只动物取心脏时所用剪刀、镊子齐用—套．以防不一样动物间相干扰。心血管疾病药效学研究第36页

(4)心肌区域血流量测定：放射微粒法测定心肌区域血流量原理是利用放射性素标识微粒注入左心房，循环微粒几乎全部组织固定，故微粒流人每个器官量(以放射性表示)与该器官血流成正比。区域性心肌血流量操作方法是用羰化塑料微球悬于含o．01％吐愠80生理盐水内，使用置旋涡混合器I—2min，取微球500万，用生理盐水稀释到l0ml，10s内注入麻醉开胸犬左房导管，再用10ml盐水冲洗导管：注射微球同时用恒速泵以6-7ml／min速度从插人动脉弓导管连续取3份参考样品，每份40s。试验结束时取出心，剔除表面脂肪、血管与心瓣膜，将左窒壁切割成每份重1～2g组织块，每块分成内膜下、中间与外膜下心肌层。用多导Y能诺分析仪记心肌与参考血样品放射。汁算心肌区域性血流量。依据阻断冠脉前后心肌组织内血流量改变．降低25％以上者为缺血，降低大于75％者为严重缺血区。用以研究药品对心肌缺血时不一样部位，不问层次心肌血流量影响。心血管疾病药效学研究第37页(5)离体心脏冠脉灌流法：哺乳动物离体心脏，插管人动脉灌流肘，灌流液须经冠状动脉经右心房流出心脏，故流出量可代表冠脉流量，在灌注压不变条件下，其流量可反应冠脉阻力改变。方法：雄性大鼠，体重200-250g，腹腔注射0．6％戊巴比罢钠45mg／kg麻醉．仰位固定，分离—侧股静脉，注入肝素125u，剪开胸．暴露心脏，动脉第—支头臂动脉发出处近端横断，速将心脏投入4C灌流液，冲洗冠状动脉中残留血液，将心脏移至lallgendoff灌流装置F端，以Krebs—Henseleit液灌流。待心脏跳动规则后，在肺动脉起始处剪一小口，以利冠状血回流液排出。心脏表面放置铂电极，连接电刺激，用于心脏起搏。灌注约15rain后，连续测定每分钟冠脉流量3次：待恒定后开始给药，／H量筒搜集流出统计给药前后及给药后每lmin流出量。同叫可测定心肌耗氧星及其它生化指标改变。

心血管疾病药效学研究第38页注意事项：药品pH及无机离子含量血靠近生理值，不然酸性药液可增加冠脉流量，须用与药品一样pH及无机离子对照剂。试验中供氧，温度、灌流压力及灌液PH要固定不变。灌流液必须用新鲜蒸馏水暂时配制。冠脉血管阻力受血管张力影响，受心肌担心度对心血管支持力影响。药品抑制心肌收缩力，可使血管阻力降低．冠脉流量增加，假阳性。为排除这种影响，可先心脏纤颤，然后观察约物对冠脉流量影响。用6V直流电产生断续感应电震直接刺激心脏，或用方形波刺激器刺激，也用交流电刺激引发心纤颤，然后测定每lmin冠脉流量改变。心血管疾病药效学研究第39页(八)心肌氧代谢试验在心肌代谢中，氧供需占有主要地位，供氧不足，耗氧增加是缺血性心脏病主要矛盾。左心室心肌耗氧量为每分钟8—10ml／100g(心肌)，工作负荷增加时每分钟可达40ml／100g(心肌)。停心肌供氧，经3次收缩即出现缺氧，所以，心肌耗氧测定是研究防治冠心病药品主要指标。心肌氧代谢研究方法约分为三类。心血管疾病药效学研究第40页1．直接测定①心肌耗氧星测定，在电磁流量汁测定冠脉血鼓同叫重复屡次测定动脉血及冠状静脉窦血氧量。可计算心肌耗氧。②心肌氧张力测定，极谱仪铂电极插入丌胸犬心肌，连续纪录心肌氧张力改变。心肌缺血时内膜下血流及氧张力下降甚于心外股，缺血什损伤及坏死也较外层心肌严重，所以，用双暴露电极测定左心室外／内膜下氧张力改变以研究药品影响，更有意义。能选择性增加心膜下氧张力药品或办法，对缺血性心肌都有保护作用。这方法仪器昂贵，国内还未广泛应用，③离体心脏心肌片或心肌组织及体外培养心肌细胞耗氧量测定，离体心脏灌流，分别测定流人液及流小液含量，可算出心肌耗氧。或用瓦氏呼吸器测定心肌耗氧量。或测氧仪直接测定心肌片耗氧量。方法简便，结果稳定。心血管疾病药效学研究第41页2间接测定①张力—时间指数，依据心肌耗氧量与心脏做功有亲密关系原理，间接推测心肌耗氧量改变。②心肌耗氧指数，依据左心室需氧量决定于心率及收缩压原理，间接推算心肌耗氧量改变。③正性肌力作用，心肌收缩力、心肌缩短速度与心肌耗氧呈线形关系，凡有正性肌力作用或延长射血时间者，均增加心肌耗氧量，可依据药品指标影响推测心肌耗氧量改变。心血管疾病药效学研究第42页

3心肌耐缺氧试验增加心肌供血(供氧)或降低能量(氧)消耗，维持能量<氧)代谢平衡，可提升心肌耐缺氧能力，国内惯用耐缺氧试验综合评价—些药品作用。①离体心脏灌流耐缺氧试验，用不一样程度低氧或无氧流液灌流离体心脏，观察心脏功效、形态及生化指标改变，可反应离体心脏对不一样缺氧程度耐受能力以及药品影响，并可用于受体作用研究，但易受体外环境影响，须严格拧制试验条件。②大鼠心肺灌流耐缺氧试验，此法除可反应离体心脏耐缺氧能力和药品作用外，可同时测定血压、心输出、心房压及静脉压等各项指标，说明这些原因与心肌耐缺氧之间关系以及药品作用。试验方法较前者复杂，但可取得较多信息，对药品研究有—定实用价值。③体外培养心肌细胞耐缺氧试验，利用体外人或动物心肌细胞，模拟临床缺血性心脏病形成缺氧缺糖性损伤细胞病理模型，用于研究药品对心肌细胞缺氧能力影响．与前述方法结合。可从器官、组织及细胞水平反应药品对心肌耐缺氧能力影响。④其它，小鼠常压或减压缺氧试验，方法简单，应用广，反应整体(尤其是脑组织)耐缺氧能力，但特异性差，不能反应心肌耐缺氧力，易受镇静、催眠或刺激性药品影响，出现假阳性。用小鼠或大鼠测定速度、存活时间及死亡时余存氧含量，能够较准确反应出整体动物耗氧速度及药品影响，较前者精细，但亦不能直接说明心肌耐氧能力，耗氧速度。心血管疾病药效学研究第43页4，其它心肌代谢除氧摄取利用外，尚包含碳水化合物，脂肪、蛋白质等方面。深入研究药品对这方面影响，是必要。酶学研究．如磷酸肌酸酶(CPK)能够定量地反应心肌损伤程度，乳酸脱氧酶及天冬氨酸转氨酶(AST)等，也惯用以反应心肌损伤度。测定动脉血，冠状静脉或缺血区血液乳酸或钾含量，较心电图及血流动力学更敏感反应心肌缺氧程度及药品影响。二者升高说明心肌缺氧。下面重点介绍几个惯用方法。心血管疾病药效学研究第44页

(1)心肌耗氧量直接测定法：经冠状静脉窦和颈总动脉插管，抽取冠状静脉和颈总动脉血，以血氧测定仪或血气分析仪直接测定血氧含量算心肌耗氧量。可与试验中同时测定其它血流动力学指标如冠脉血流量、血压、心电图等连续描记于生理统计仪，进行比较研究。方法：健康成年犬，戊巴比妥钠(30mg／kg)静脉麻醉．开胸手术同前，从颈外静脉插冠状静脉窦，同时颈总动脉插管。药前及药后不一样时间抽取血样进行血氧测定，与其它血流动力学指标同时纪录相比较。注意事项：熟练掌握冠状静脉窦插管技术，保持导管在冠状静脉窦内正确位，以确保血流通畅。取血量要适度，防止抽取血量过多而造成缺血。心血管疾病药效学研究第45页(2)氧电极测定心肌耗氧率方法：氧电极怯测定系利用氧在极化电压下溶解氧被还原而产生电流。所以当测定系统将电极与被测溶液用能经过气体分子聚乙烯薄膜隔开后，在一定极化电压下电极中测电流量将只反应破测系统弥散过来氧，故与被测溶液中氧分压成正比，与组织耗氧成反比，从而能够反应组织代谢活动。方法：大鼠或家兔随机分组，给药或对照液后，分别测定心肌耗氧量或结扎冠状动脉形成心肌缺血。再经—定时间后处死动物，取心肌梗死区及对照区心肌组织，于冰浴上切、称重，加入心肌孵液，于37℃恒温水浴平衡，然后将孵育液注入测氧仪，测氧分压，孵育前后氧分压差值即为该组织耗氧值。试验时，每份样本检测2～3次，取其均值。注意事项：本法为整体试验，离体测定，可对正常心脏或缺血心脏进行不一样部位心肌耗氧量测定，反应药品对正常及缺血心肌耗氧影响，方法简便，快速、易普及，但影响原因较多，嘛醉、呼吸状态及供氧情况，心肌标本处理从测氧条件控制，仪器稳定性与灵敏以及试验环境温度改变等，均可影响试验结果作用。

心血管疾病药效学研究第46页(3)非特异性方法：小鼠常压耐缺氧试验法方法：将lo个250ml或500ml磨口广口瓶放入钠石灰10g，上垫滤纸。然后每瓶放人一只小鼠，各组动物分别给生理盐水或药品。将小鼠放入瓶后，将徐有凡士林瓶盖盖紧，统计时间，观察各组动物存活时间。可用玻璃干燥器代替广口瓶。用纸板隔为小格，每格放入小鼠一只，干燥器内放入一定量钠灰或氢氧化钠氯化钙等量，用以吸收水分和二氧化碳。或用装有氧电极橡皮塞塞紧瓶，使氧电极与瓶内气体接触，连接测氧仪，可测出瓶内氧量改变，反应耗氧速度。注意事项：此法特异性较差，大脑比心肌对缺氧更为敏感，很多有中枢抑制药品或刺激性约物腹腔注入可降低动物活动，降低机体耗氧量，也能延长存活时间，出现假阳性结果。(4)小鼠低压耐缺氧试验法，本法与常压耐缺氧试验法相同，但将小鼠放入密封低压容器内。心血管疾病药效学研究第47页厥脱证药心血管疾病药效学研究第48页一、试验设计医学基础厥脱证是指邪毒内陷或内伤脏气、气阴耗竭或亡津失血所致气血逆乱，正气耗脱一类症证。厥证是指邪热内陷或阴寒内盛所致四肢逆冷病证。脱证为阴阳气血衰竭危重证候，厥证由轻转重致脱，脱证早期可为厥，厥脱不一样于单纯厥证或脱证，是由厥至脱，厥脱并见临床综合病证，以手足厥冷，大汗淋漓，脉微欲绝，神志烦躁，冷淡或昏迷为临床表现。临床厥脱证已经有较明确辨证指标和治疗准则。厥脱证分为寒厥证、热厥证、阴脱证，阳脱证、气血两脱和阴阳俱脱证等。厥脱各证相互转化，热厥证外感温热病，热毒内陷．高热致厥，深入发展，热毒炽盛、内攻脏腑、阴液大耗而致阴脱证，也可热伤气阴，阴阳离决，阳气暴脱而致阳脱证。阳脱证治疗以回阳救逆固脱为主；阴脱征治疗以益气养阴固脱为主。依据辨证标准，可分为气阴两亏，阳气暴脱，真阴耗竭，热毒炽盛，心气不足，气滞血瘀等六型，各型之间能够相互挟杂。厥脱证临床表现相当于当代医学各种休克和循环衰竭。引发原因各种．如久血性、感染性、心源性、创伤性，过敏严重性休克等。休克是一个急性循环功效不全综合征，是有效血液循环不足，使全身组织和主要脏器血液灌注不足，造成组织缺血缺氧，微循环淤滞，代谢索乱和脏器功效障碍等一系列改变。心血管疾病药效学研究第49页二、药效学研究试验设计(一)对厥脱证动物模型治疗作用试验1．惯用动物模型(1)失血性休克模型：用动脉急性放血方法，急性失血达总血量15％—20％时，就发生休克，待血压降至5．3kPa时便到达难逆性克。可选犬、猫进行试验，大鼠及兔较差。(2)感染性休克模型：用活菌、内毒素或脓毒病灶复制感染性休克模型，可选取小鼠、大鼠，兔、猫，犬等。(3)心源性休克模型：用理化等有害刺激，损难过肌，造成局部心肌坏死；结扎冠状动脉主要分支，造成心肌缺血性梗死；将塑料微球注入到冠状动脉内，造成冠状功脉栓塞；在心导管上附上不锈钢电极，插入到冠状动脉，通以弱电流，造成冠状动脉血栓及心肌缺血性栓塞等造成心源性休克动物模型。可选取犬、猫、小型猪等。心血管疾病药效学研究第50页

(4)创伤性休克模型：用止血带造成动物肢体缺血引发创伤性休克；重复锤动物腿部肌肉；用木板及钳连续挤压动物腿；牵扯肠襻；损伤胸腔器官等均可引发创伤休克。惯用动物有小鼠、兔、猫等。(5)过敏性休克模型：用抗原物质致敏动物后，注入相同抗原，就可引发急剧休克反应。最惯用动物是豚鼠，其次是兔、大鼠、小鼠，犬等。(6)肠系膜上动脉夹闭性休克模型：夹闭肠系膜上动脉，引发肠道缺血，当一段时间后，恢复血液供给，此时即引发休克。可选大鼠、免等。(7)其它类型休克：烧伤、疼痛、胰岛素休克、微循环障碍、弥漫性血管内凝血等动物模型，亦可适当选取。2观察指标(1)模型动物死亡率：小动物休克模型以休克动物死亡率影响评价有效性。(2)相关指标：如与休克病理性情况改进相关血流动力学和血液生化学等。心血管疾病药效学研究第51页

3．方法学评价上述各种方法造成模型，可依据新药主治和功效选。阳脱证临床上以神志冷淡、面色苍白，四肢厥冷，冷汗淋漓为主证，兼息微唇绀，脉微欲绝或不能触及，血压下降，尿少，与临床“阳脱证”表现相近似动物模型如：感染性休克晚期、失血休克晚期及心源性休克模型等。气血两脱，由急性失血引发，即失血亡阴之脱证，用失血性休克代偿期和失代偿早期作为气血两脱证动物模型，如为失代偿晚期，属阴阳俱脱证。阴脱证与感染休克脱水症状相同，可用肠道致病菌感染动物，造成严重泄泻，脱水；亦可用内毒素或脓毒病灶引发休克，烧(烫)伤性休克动物亦可作为阴脱型模型。心血管疾病药效学研究第52页(二)其它试验1.血压及微循环因为阳脱证(亡阳)和阴脱证(亡阴)，均血压和微循环异常，必须进行血压从微循环观察。2.血流动力学、心功效及主要内脏血流量药品对整体动物血流动力学和心功效以及对心、脑、肾等主要内脏血流量影响，关系到药效作用，应进行这方面试验。3．依据不一样休克动物模型，增加相关病因试验(1)治疗邪毒内陷之脱证药品：除进行上述相关休克模型外，还做①祛邪相关试验，如抑苗、抗病毒、反抗毒索、抗炎、解热等试验。②扶下相关试验，如抗应激能力试验、免疫功效试验、物质代谢试验及内分泌功效试验等。(2)治疗心气十足药品：可增加心功效衰竭模型、心功效测定及血流动力学等相关试验。(3)治疗与气脱类似过敏性休克药品：或增加过敏试验等内容。(4)治疗猛烈疼痛致脱药品：可增加镇痛等试验。4．其它还有主要脏器血流量如脑、肾及冠状动脉血流量测定、自由基测定及各种酶测定、电镜微观结构观察等对说明厥脱证药品机制是必需。心血管疾病药效学研究第53页

(三)阳性对照药阳脱证治疗以回阳救逆固脱为上，可用参附汤、四逆汤、参附注射液、参附青注射液等作对照；阴脱证治疗以益气养阴固脱为主，如生脉散、参麦散、生脉注射液、茶麦注射液等作对照。也可用多巴胺等作对照。

三、动物模型建立方法(一)厥脱症失血性休克模型1．原理以动脉急性放血、急性失血达血量15％-20％时，就可发生休克，待血压降至5．3kPa(40mmHg)时便到达休克。心血管疾病药效学研究第54页

2操作方法将麻醉猫股动脉插管并连接储血瓶供放血和储血用，用肝素钠10mg／kg抗凝，开始放血每分钟为2ml，当血压低于10kPa，改为分钟O．5ml，放血使血压降至5．3kPa，此时为失血代偿期。如血压下降，抬高储血瓶回输出血液，待储血瓶内最大放血量40％血液自动回输机体时作为失代偿朋，总放血量为20—30ml／kg，此时再将全部放出血液输回机体，同时静脉注射试验给药，对照组以等量生理盐水静脉滴人。阳性药组以多巴胺进行比较。观察血压、呼吸、心电图、最大放血量、存活率等。3．造模成功指标和药品疗效观察放血使血压降至5.3kPa(40mmHg)，此时为失血代偿期，此时给予治疗厥脱证新药，同时输血液，血压可回升，动物可存活。4注意点(1)放血速度不宜过快，不然会突然死亡。(2)如动物进入失代偿期晚期，此时将全部放出血液输回机体，仍有95％-98％动物死亡。心血管疾病药效学研究第55页(二)感染性休克模型1．原理内毒素是细菌主要致病因子之一，在微量时引发发烧，大量进入血液则引发循环衰竭造成厥脱证而致死亡。2．操作方法用大肠杆菌内毒素或内毒素静脉注射造成感染性中毒性休克，可用小鼠、大鼠、兔、猫、犬等。麻醉犬静脉注射大肠内毒素，观察中毒性休克血流动学改变和抗休克作用，亦可进行血液生化及酶学指标观察。3．造模成功指标和药品疗效观察内毒素注射早期，DAP，MAP，指标下降快速。15min时，各指标有不一样程度回升，60min后，冉度出现降低，维持在休克时水平．药效依据给药后上述指标情况，观察给药后2h内，2h从3h后，外周血压指标情况，应与对照组有显著差异。

心血管疾病药效学研究第56页4．注意点(1)试验用大肠杆菌内毒素可由干燥大肠艾希菌制备，经毒力测定后封装在安钵内，保留备用。细菌内毒素种类很多，惯用大肠杆菌、鼠伤寒杆菌、各种痢疾杆菌、马流产杆菌等制配方法、纯度及动物敏感性不一样，其毒力不一样，如鼠伤寒杆菌内毒素对小鼠LD50为3mg／kg左右，而黏质沙雷杆菌者达35mg／kg。试验前必须测定所选内毒素对所用具系动物毒力。(2)自制内毒素可选取高毒力菌株增菌培养后刮下菌苔，然后按WestphaI热酚法制备。也可用加热杀死高毒力阴性细菌苗悬液作粗制内毒素。(3)静脉注射内毒素所致小鼠死多发生于24h内，宜在24h内统计小鼠死亡时间。心血管疾病药效学研究第57页

(三)心源性休克模型1．原理用犬冠状动脉前降支分段结扎，结合冠状插管阻流，使心肌缺血缺氧，心肌细胞受损，心肌收缩性能及心脏泵血功效显著下降，全身血压下降，使主要器官血液灌注不足而处于休克状态。2．操作方法用犬以戊巴比妥钠25mg／kg静脉注射麻醉，分离股动脉与股静脉，静脉插管连接二通，一侧供输液，一侧供给药。做气管插管，接人工呼吸机。正中开胸，剪开心包，冠状动脉前降支末梢、根部下分别用小圆针穿入细丝线。股静脉导管上连流量计探头，将冠状窦插管与导管另一端相连；从心耳剪—小口快速插入冠状窦插管，用粗线将心耳与插管扎上；从心底部沿房室沟将插管插入冠状窦；轻轻扎住插管预防滑，保持回流导管通畅。颈外静脉插入高敏感度压力换能器达右心房测中心静脉压(CVP)，左股动脉测平均动脉压。左颈总动脉插入压力换能导管直至左心室测左室压峰值；同时测左室压力改变速率正负最大值左室舒张末期压(NEDP)。用体温仪测下体温。同时测心电图(ECG)和心率(HR)和冠状窦血流量(SCBF)，各项指标均统计于多道生理统计仪。心血管疾病药效学研究第58页3造模成功指标和药品疗效观察待犬MAP稳定在10kPa以上时，每隔5min顺次结扎冠状动脉前降支末梢、中部与根部，5-10min后阻断冠状窦血流。待MAP下降至9．3kPa或原血压(10-13kPa)70％以下者视为休克。从第一次结扎到MAP降至休克水平平均时间为76．4min，休克动物ECG均发生缺血性改变，MAP、LVSP均显著下降，BT降低，CVP、LVEDP上升但无显著统计学意义。药效可依据绐药后能否使休克动物MAP增加，使LYEDP与冠状血管阻力(CVR)和CVP下降，同时可用阳性药多巴胺作对照。心血管疾病药效学研究第59页

4．注意点(1)麻醉不能过深，动物MAP低于10kPa时弃去不用。(2)操作过程中尽可能防止损伤血管，出血点应结扎或烧灼止血。(3)冠状插管不可插入太深，方向应与心脏房室曲线吻合。(4)结扎冠状动脉部位次序不能错．先结扎根部易引发动物死亡。(5)多巴胺(DOP)是公认治疗心源性休克有效药品之一，能显著改进本休克模型心肌收缩性能与心肌供血，升高血压等。心血管疾病药效学研究第60页(四)创伤性休克模型1．原理以—定重力自一定高度自由落下，造成股骨粉碎性骨折，用止血带造成动物体缺血再灌注损伤；重复锤击动物肌肉等均引发创伤性休克。2．操作方法取健康家兔，腹腔注入乌拉坦麻醉，颈总动脉插管经生理统计仪监测血压，左股动脉插管以备取血样。创伤组以一定重力自一定高度自由落下，造成兔右侧股骨中段粉碎性骨折；防治组创伤方法同上，创伤前l0min和创伤后即刻静脉注入被试药品；对照组插管手术同上，但不造成创伤。三组动物血样时间均相等。心血管疾病药效学研究第61页

3．造模成功指标和药品疗效观察创伤组动物试验后2h血压降至6．82kPa，显著低于防治组(11．76kPa)和对照组(13．5kPa)，，血浆乳酸脱氢酶和组织蛋白酶活性以及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量均显著高干防治组和对照组，同时心、肺、肾及胃黏膜等组织MDA含量和钙含量较防治组和对照组显著增高。创伤组动物肺湿／干重量比显著高于对照组，肺泡表面活性物质显著降低，创伤组动物胃黏膜见点状、条索状和片状缺损，并有血现象。4.注意点(1)每次造成创伤物体重量、高度、创伤部位，严重程度要一致。(2)取样时间要相等，测定各项指标要准确。心血管疾病药效学研究第62页(五)肠系膜上动脉夹闭性(sMAO)休克模型1原理休克发生可能与肠道缺血再灌注时自由基及其它各种毒物质产生相关。自由基不但造成肠组织脂质过氧化损伤，也可造成肠外生命器官如心、肺、肝等组织脂质过氧化损伤，自由基参加此休克时细胞损伤过程。2．操作方法取纯系大鼠，体重250g左右，用13．3％乌拉坦与l％氯醛糖混液06ml／100g(体重)腹腔注射麻醉，气管插管，自主呼吸。左颈总动脉插三通开关，按压力换能器，连于二道生理统计仪统计血压。右颈外静脉插管供给药用。腹部正中切于，生理盐水纱布保护下分离出肠系膜上动脉，以上创伤动脉夹夹闭，关闭腹腔，动物全身肝素化(80ul／100g(体重)]，关闭动脉1h后松夹。给药组可在松夹前20min右侧颈外静脉注入试验药品。经过塑料三通左颈总动脉取血，分别测定夹闭前、松夹后1h、2h三个时间全血谷胱肽过氧化物酶活力。至松夹2h，取动物心、肝、肾准确称量1g，测定GSH活力，按DTMB直接法测定。以Folim—酚试剂法作蛋白定量。对照组用等容量生理盐水。其余条件均同给药组。心血管疾病药效学研究第63页3．造模成功指标和疗效观察造模成功动物在松夹即刻，松1h、2hMAP、脉压均下降。全血及心、肝、肾组织活力降低。受试药品应能使MAP升高，全血及心、肝、肾组织GSH-Px活力显著升高。4注意点①在分离大鼠肠系膜上动脉时，尽可能防止出血或过多牵拉。用无创伤动脉夹闭要完全。②作匀浆前心、肝、肾组织尽可能剪碎，匀浆时每次时间和频率要保持一致。③必需注意各试剂配制和保留方法，以免影响结果。④按酶学反应温度、PH和时间进行，同时须准确计时和读数。心血管疾病药效学研究第64页心律失常药心血管疾病药效学研究第65页

一、试验设计医学基础心律失常是指心脏活动节律不正常。正常情况下，心搏激动起源于窦房结，节律基本规则，频率有—定范围，沿窦房结——左右心房——心室传导路径，以一定速度传输到左右心室。凡偏离这种正常心律心脏搏动都属心律失常，它由心脏中节律性或激动传导障碍或二者同时失常引发。心律失常同时包括心脏电活动和机械性搏动节律，但虽显著最准确地从心脏电活动改变中反应出来，所以心电图是反应心律最主要最直接指标。心脏功效、血供、神经调整等任—项异常均部分或完全引发心律失常，如各种器质性心脏病、全身性疾病(感染、缺氧、中毒、电解质紊乱、药品作用)、一些系统疾病(甲亢、颅内出血等)、麻醉、胸腔手术、自主神经功效失调等。中医学中类似心律失常症状描述散见于心悸、怔忡、眩晕、昏厥等病症中，病位以心为主，与肝、脾、肾、胃等关系亲密，表现为虚(气、血、脏腑)、实(瘀、滞、痰饮)两类，虚多见于气血不足，阴阳失调和血脉瘀阻等原因引发。心血管疾病药效学研究第66页心律失常治疗首先是确定病因，明确心律失常发病原因及其相互关系，在治疗病因同时依据需要治疗心律失常。当代医学抗心律失常药品主要分为四类：钠通道阻断剂，它主要抑制内向快速除极，钠流动，从而延长动作电位上升速度，主要分为三个亚类：In除极作用中等，而复极延长，如奎尼丁、普鲁卡因酰胺、双异丙肾上腺素等；Ib兼有促进K外流作用，除极作用弱，复极作用缩短(对P—R、QPS、QT无影响)，如利多卡因、美西律、妥卡尼、苯妥英钠；lc除极作用强，复极作用甚小，如普罗帕酮、氟卡胺、Lorcninine等。Ⅱ类为肾上腺素能受体阻滞剂，如Nadolol、Pindolol、Sotolol、Timolol等。Ⅲ类为复极化抑制剂，如胺碘酮、Stolol等。Ⅳ类为钙通道调整剂，阻断钙通道Ca内流，使心肌细胞去极化减慢。中医可用补益养血、滋阴和阳疏通血脉等方药，防治“脉结代”，具抗心律失常作用。受试中药其它相关药效作用如补益、理气等，可依据受试物情况而增加。心血管疾病药效学研究第67页二、药效学研究试验设计(一)对心律失常模型防治作用1．惯用动物模型主要两类模型。过速型心律失常模型。(1)电刺激心脏诱发心律失常：适度电刺激靠近自然异位冲动，可诱发心律失常。(2)外科手术或机械损伤形成心律失常：由传导延缓解折返激动以及舒张自动除极和异常自律性所致。包含：①冠状动脉结扎形成缺血性心律失常；②冠状两期结扎形成心律失常。

心血管疾病药效学研究第68页(3)化学药品诱发心律失常：惯用有①肾上腺素诱发心律失常。肾上腺素兴奋受体，心脏自律性、传导性、应激性及心率提升，诱发室性心律失常，②氯仿诱发小鼠心室纤颤。可能与自主神经及具递质释放、或肾上腺髓质分泌肾上腺索，以及对心脏直接作用相关。③乌头碱诱发心律失常。能使钙通道开放，促进细胞去极化，加速起搏点自柞性，形成多源性异位节律，缩短不应期。④弧心苷诱发心律失常。直接抑制Na—K-atp酶，使心肌细胞内Na多K少，使心室自律性增高。⑤氯化钡诱发心律失常。增加蒲氏纤维Na内流，提升舒张期去极化频串。⑥氯化钙诱发心律失常。钙增加能降低蒲氏纤维兴奋性显著增加普通心肌去极化，造成局部传导阻滞，并增加冲动扩散不齐。⑦乙酰胆碱诱发心律失常。缩短动作电位及不应期，使心肌不一样部位兴奋扩散不一致，造成折返形成。心血管疾病药效学研究第69页迟缓型心律失常模型(1)维拉帕米(异博定)诱发小鼠迟缓型心律失常：抑制心肌细胞内Ca流，抑制房结和减慢房室传导。(2)麻酐剂诱发心动过缓模型：尿酯能阻断中枢神经突触传递，对心脏也有抑制作用，麻醉后出现一过性心率减慢，多在10min内恢复正常。(3)烟碱诱发心动过缓模型：烟碱先兴奋后抑制血管运动中枢、交感神经节、肾上腺髓质及颈动脉化学感受，表现心率减慢、血压下降、窦性停搏等。2．观察指标纪录ECG，也可专心电示波器进行监测．观察项目有①心律失常(室性早搏VP、室性心动过速VT)出现时间，心律失常程度，药品作用维持时间，恢复窦性心律动物数／动物总数。②房颤或室颤发生率和死亡率。③Ⅱ、Ⅲ度房室传导阻滞。心血管疾病药效学研究第70页

3．方法学评价(1)动物：小动物(大鼠、豚鼠、家兔、猫)心室纤颤有自发恢复可能，因为冲动在比较短通路中，可能在仍处不应期区域内消失，异常兴奋波将不可能形成环形运动。豚鼠心脏地对心血管药品感受与人相同，兔耳静注给药方便，适宜在不麻酢条件试验，猫对作用于心脏药品感受性很好，体格健壮，适宜作开胸手术，固定电极等试验，大鼠易得．但对强心甘不敏感。大动物(狗、猴、猪)心室纤颤极难自然恢复，研究病因狗最适宜，猪冠状血管系统与人相同，现在越来越多地采取小猪以冠状动脉结扎方法形成心律失常。(2)整体动物形成心律失常在麻醉或清醒状态下试验，不但能观察受试物作用，后者还能观察受试物毒性。离体心脏标本也可形成心律失常。心血管疾病药效学研究第71页(3)心律失常恢复通常以恢复窦性心律，连续30min下再复发为恢复；心律失常连续时间以自心律失常一直到恢复窦性心律为止，减去中间间断恢复时间。(4)结扎冠脉、大鼠静注乌头碱形成心律失常模型较稳定和持久，可供试验治疗，其它模型多用于预防给药。(5)当心律失常连续叫间较短，无法进行试验治疗时，采取先行给药品，再造成心律失常，在一样条件下，比较对照组与给药组形成心律失常时间、程度、连续时间或诱发心律失常所用化学物质剂量等，这可视为预防给药保护作用。考查治疗作用可选择能维持心律失常较长叫间动物模型，心律失常发展相对稳定阶段绐受试药品，观察指标，判断疗效。心血管疾病药效学研究第72页

(二)其它试验1离体豚鼠右心室乳头肌试验离体豚鼠右室乳头肌标本固定在改良台氏液灌流槽中，给与基本节律电刺激，稳定1-2h后，对窦房组织进行微电极探查，找出窦房结搏起细胞，并使动作电位稳定，开始试验测定及统计。试验采取常规心肌细胞内微电极技术。基本节律刺激参数为波宽1ms，频率1Hz，强度为阈强度2倍，对同一细胞分别纪录和测试给药前、后和冲洗动作电位改变ERP改变，将细胞分组给予奎尼丁50ug和待测药品。2离体家兔窦房结起搏细胞动作电位将制好家免窦房结标本固定在充以95％O2+5％CO2R-L液灌流槽中．稳定1-2h，对窦房结进行微电极探查，找出窦房结起搏细胞，并使动作电位稳定，然后分别纪录细胞在给与待测药品前、后和洗后动作电位改变，比较：MPR、APD、SRVP4、SEF和APA。心血管疾病药效学研究第73页(三)阳性对照药与已知公认临床疗效很好类似药进行对照，最好选取作用类别相同中药成药，也可酌情用疗效明确西药及新药。受试药给药方法中最少有一个与临床相同。假如受试药为中药提纯物，水溶可用静注或具他注射方法，如系中药粗制剂，一定要灌胃或注入十二指肠内，口服或灌胃通常在形成心律失常前1h或更长时间给药，腹腔注射或十二指肠注入应在10～15min前，皮下、肌内注射通常在20-30min前给药。心血管疾病药效学研究第74页三、动物模型建立方法(一)电刺激脏诱发心律失常1．原理适度电刺激完全是可逆，不损难过肌，比其它方法更靠近自然异位冲动，可因刺激电极度所按位置不一样诱发房性和室性心律失常，随刺激强度不一样可引发早搏。心动过速、扑动或纤颤可连续试验2—4h。2．方法①猫雌雄不拘，体重2—3kg，戊巴比妥(35-45mg／kg)腹腔注射