电镜技术及超薄切片技术研究生医学

电镜技术及超薄切片技术研究生医学第1页/共44页

电子显微镜室简介我室的电镜型号和性能如下：H-600A型透射电镜，购于1989年，最大点分辨率为0.36nm,有效放大倍数达30万倍。H-7500型透射电镜，购于2004年，最大点分辨率为0.24nm,有效放大倍数达60万倍。S-3000N型扫描电镜，购于2004年，有效放大倍数达30万倍。第2页/共44页

1924年，法国物理学家Broglie提出了“电子与光一样，具有波动性“的假说，并计算出电磁波长为0.005nm.1926年，德国科学家Busch发现了带电粒子在电场或磁场中偏转聚焦的现象，类似于光线通过透镜可被聚焦一样。

1928—1931年间，德国年轻的大学生Ruska测量了磁透镜的聚焦特性，并开展了电子放大成像的研究，终于在1938

年成功研制了世界上第一台真正的电子显微镜，放大倍数为

1200倍，被誉为电子显微镜之父。，并在1986年获得诺贝尔奖。

20世纪50年代初到60年代末期，电镜发展很快，从性能到构造都得到很大的改进，特别是分辨本领得到大幅度提高，达到1nm左右，到80年代的点分辨率已接近0.1nm，最新研制的超高压透射电镜的点分辨率可达0.005nm。

电镜的发展历程第3页/共44页电镜的基本类型：

1、透射电子显微镜

2、扫描电子显微镜

3、分析电子显微镜

4、超高压电子显微镜

5、扫描探针显微镜

（扫描隧道显微镜、原子力显微镜、扫描光子显微镜等）第4页/共44页

一、电子显微镜的原理和结构

光的衍射现象：

由于光具有波动性，当光线通过小孔或小孔光源经光学系统成象会产生衍射。其图案是:中央部分一个亮斑，在其周围有明暗交替的园环。2D

D=第5页/共44页

可以这么说，显微镜分辩本领是由其产生的衍射图中央亮斑半径D（分辨能力）而定：

阿贝公式：

D=

当光的波长为λ=500nm=0.5μm

介质折射率N（油）=1.5

物体与物镜所形成夹角的半数α<90º

中央亮斑的半径D=200nm=0.2μm

第6页/共44页分辨本领测算：1、人眼在明视距离250mm处能分辨0.2mm的两点。

油镜最小能分辨0.2μm的两点。

则油镜理论最大放大能力为：

0.2mm/0.2μm=10002、假如一台电镜的点分辨率为0.1nm,则其理论放大倍数为：0.2mm/0.1nm=2x1063、H-7500型透射电镜的点分辨率为0.24nm,则其理论放大倍数为：0.2mm/0.24nm=0.83x106。而其有效放大倍数为0.6x106第7页/共44页瑞利准则

光线通过二个比较靠近的小孔时，这二个小孔的衍射图会重叠在一起。当一个衍射图的中央亮斑正好落在另一个衍射图的第一暗环中心时，这二个点刚可以分辩。这就是显微镜分辩本领的瑞利准则。第8页/共44页运动着的电子所产生电磁波长为：

λ=(nm)

如V=50000v

则λ=0.005nm=0.000005μm

是光的λ=500nm的10万分之一，大大减少了衍射光斑D的值。第9页/共44页

光学显微镜与电子显微镜在工作原理上的比较：

光学显微镜是利用玻璃制作的透镜对光进行折射，将一物点发出不同角度的光线最终会聚成一个像点。

电子显微镜是利用电场或磁场折射电子束，达到成像目的。

第10页/共44页光源聚光镜样品物镜投影镜最终象透射电子显微镜光学显微镜第11页/共44页

镜筒内部结构示意图：

1)照明系统：电子枪聚光镜2）样品室3）成象系统：物镜中间镜投影镜4）观察记录系统：观察室照相机

第12页/共44页一、电子显微镜的照明系统1、电子枪一般安装在镜筒的顶端，是一个由阴极、栅极和阳极三个部分组成的结构。大多数阴极为热阴极。灯丝为钨灯丝，呈V形，尖端向下，其余两端连接电源。2、聚光镜由铁壳包裹的线圈构成，通入电流后乃形成电磁场，使由电子枪发出的电子束进一步密集聚拢，以增强其照明效果。聚光镜的中央位置装有极靴，其作用是籍以增强磁场强度，而磁场强度可通过改变所加电流大小来调节，以达到根据需要调节放大倍率和对所形成图象进行聚焦的目的。一般电镜都设有二级聚光镜。第13页/共44页二、电子显微镜的成像系统1、物镜由铁壳包裹的线圈组成，是电镜成像系统的关键性部件。在物镜中心位置同样装有精密度极高的极靴，以及要求很高的肖像散部件，以尽量消除成像过程中难以完全避免的像散现象，保证成像的清晰度。在物镜的后焦面装有可动光阑片，可根据具体情况来调整光阑孔的大小。2、中间镜也是由铁壳包裹的线圈组成，位于物镜和投影镜之间，作用是将物镜所成的放大像进一步放大。目前高档的电镜可设有三极中间镜。3、投影镜也是由铁壳包裹的线圈组成，作用是将以上成像进一步放大并投影于荧光屏上，激发荧光，形成影象。第14页/共44页三、观察记录系统1、荧光屏为圆形平面结构，上面涂以荧光粉，当高速电子撞击其表面时，便激发出荧光，从而使观察者能通过含铅玻璃窗口直接看到影象。2、照相室在荧光屏的下边，装有电镜软片，通过电子束直接轰击软片表面而使软片爆光，从而使观察影象以底片或照片的形式保存下来。第15页/共44页四、真空系统

由低真空和高真空两极真空泵构成。前者称为机械泵，排气气压达0.01mmHg;后者称为扩散泵，排气气压可达0.0001mmHg以下。真空系统的作用是使镜筒内部获得高真空。如果镜筒内真空度较差，将会:1）气体分子与高速电子相互作用，随机地散射电子，降低象的反差。

2）电子枪中存在残余气体，会产生电离和放电，引起电子束发射不稳定。

3）残余产体与白灯丝发生作用，降低灯丝寿命。

4）残余产体在样品周围会污染样品。第16页/共44页

五、供电系统它是由以下三个部分组成

1）高压电源：使电子获得一定的速度。通常电压为25KV、50KV、75KV和100KV。

2）磁透镜激励磁电源：它提供了磁透镜所必需的电源，从而使磁透镜周围有一个特定形状的磁场。

3）辅助电源：例如真空系统控制电源、调焦和嚗光装置、照相机自动控制和记数电路等等。第17页/共44页六、辅助系统

1）水冷系统：是用水冷却油扩散泵、磁透镜的线圈等，保证设备正常工作。

2）气动系统：采用压缩空气作为动力，将各种阀门按程序要求打开或关闭，完成所须任务。第18页/共44页透射与扫描电镜原理图解第19页/共44页扫描电子显微镜工作原理

就是通过极细的电子束扫描标本表面而激发出二次电子，并被接收到阴极射线管而成像。

扫描电镜由两个主要部分组成：

探查系统和显示系统

第20页/共44页一、探查系统：由电子枪、电磁透镜组成。

电子枪发射电子束（加速电压在1—50KV），经过电磁透镜的作用，射击标本表面，使之产生二次电子。二、显示系统：电子检测器，闪烁器、光电倍增器以及显示屏组成。

由电子束激发的二次电子被位于检测器前端的栅极所吸引，并被强正电场加速飞向闪烁器。当电子击中闪烁器时，后者乃产生光子，光子沿导光管引向光电倍增器，并在此产生光电子，此信号经放大后被传输到阴极射线管（显示屏），从而在此成像。第21页/共44页透射电子显微镜拍摄的照片扫描电子显微镜拍摄的照片第22页/共44页

电子束的穿透能力一般较弱，大多数标本无法直接在电镜下观察，必须把样品切成厚度为10—1000nm的薄片。这种切片称为超薄切片，是电镜观察生物样品常用方法之一。(1)

超薄切片技术二、透射电子显微镜样品制备第23页/共44页

1）取材取材的要点是快、小、冷、准，组织要新鲜。快：取材时间在1—2分钟以内完成；小：体积大小在1立方毫米左右或横切面为1平方毫米的长条形；冷：固定液温度在4摄氏度左右。准：取材部位要准确，尽量取材于所要观察的部位。第24页/共44页取材方法：

1、器官组织取材法：主要针对活体器官组织的取材如肾、肝、肺等活检组织。

2、游离细胞收集法：主要针对培养细胞及游离细胞如血细胞、脱落细胞等。常用方法有血浆凝集法和琼脂预包埋法。

第25页/共44页双刀拉锯法第26页/共44页2）固定

固定的目的是被研究的材料尽量保持生活状态时的组织结构，避免因缺血缺氧所带来的“死后变化”。

固定方法分物理固定法和化学固定法

1、物理固定法：微波快速高温、冷冻或干燥

2、化学固定法：使用化学试剂-固定剂

3、常用固定剂：2.5%戊二醛、1%锇酸、

5%高锰酸钾、10%福尔马林、等。第27页/共44页1．组织块固定：适用活组织检查，如肾、肝、胃肠道等等。常规采用戊二醛—锇酸双重固定法。2．游离细胞的固定：适用于培养细胞、周围血、骨髓、胸腹水或其他渗出液。如为贴壁生长的培养细胞，应先用橡皮刮子将细胞从培养管壁上轻轻刮下，或用酶消化，使细胞脱离管壁，然后按以上方法固定。有离心法和悬浮制备法。3.原位固定法：在组织表面滴固定液或注射固定液的方法。4．灌注固定法：即通过血管将固定液灌注到所要固定的组织中。通常采用的固定剂为2%～4%戊二醛溶液或者4%多聚甲醛溶液。化学固定方式分：第28页/共44页常用固定剂的性质1．四氧化锇

(osmiumtetroxide，OsO4):四氧化锇又名锇酸，是强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应使脂肪得以固定。此外，四氧化锇还能固定脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定。它还能与变性DNA以及核蛋白反应，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定的样品图象反差较好。固定的时间一般为1小时左右,其蒸气对皮肤、呼吸道粘膜及眼睛角膜有伤害作用。注意通风和避光。

第29页/共44页2．戊二醛

(glutaraldehydeC5H8O2)

戊二醛的优点是对糖原、糖蛋白、微管、内质网和细胞基质等有较好的固定作用，对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，还能保存某些酶的活力，长时间的固定(几周甚至1～2个月)不会使组织变脆。缺点是不能保存脂肪，没有电子染色作用，对细胞膜的显示较差。另外还有10%福尔马林、5%高锰酸钾等。第30页/共44页3）漂洗

组织块固定后，必须彻底洗净固定液的残余。在戊二醛—锇酸双重固定的组织块，力求将戊二醛洗净后浸入锇酸液中，防止二者起化学反应而降低固定效果。常用漂洗液为0.1M的磷酸缓冲液（PBS）。第31页/共44页4）块染

就是对组织块进行整块染色。一般在脱水前用1%醋酸双氧铀染色，时间为1—2小时。第32页/共44页

5）脱水

为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。急骤的脱水会引起细胞的收缩，因此，脱水应梯度进行：70%丙酮15分钟，80%丙酮15分钟，90%丙酮15分钟，100%丙酮１0分钟(二次)。第33页/共44页6）浸泡与包埋浸泡：使某种适宜的液体介质（包埋剂）渗入组织块取代脱水剂。包埋：使浸入的介质经高温处理后聚合为坚固体，利于超薄切片。常用包埋剂：Epon-812环氧树脂、DDSA、MNA以及加速剂DMP-30等。（高温处理）液体————固体

第34页/共44页包埋剂的理想性质理想的包埋剂应具有以下性质：(1)．粘度低，容易渗入组织；(2)．聚合均匀而充分，聚合前后体积变化小；(3)．有良好的切割性能；(4)．能耐受电子束轰击，高温下不变形；(5)．对细胞成分抽提少，微细结构保存良好；(6)．在电镜的高倍放大下，本身不显示任何结构；(7)．材料来源丰富、易得，价格低廉，对人体无害。第35页/共44页透射电镜样品制备操作流程：取材——漂洗（生理盐水）——前固定（2.5%戊二醛，4ºC冰箱2小时以上）——漂洗（0.1M磷酸缓冲液，3次，45分钟）——后固定(1%锇酸1小时左右）——漂洗（0.1M磷酸缓冲液，3次，45分钟）——块染（1%醋酸铀2小时）——梯度脱水（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分钟，100%2次，各10分钟）——浸透（丙酮：包埋液=1：1，37ºC烘箱2小时；丙酮：包埋液=1：4，37ºC烘箱过夜；纯包埋液45ºC烘箱2小时）——包埋聚合（45ºC烘箱3小时，65ºC烘箱48小时）第36页/共44页常用包埋剂1．环氧树脂Epon812:为进口分装，聚合前后体积变化小(收缩率为2%～5%)，切片在电子束照射下稳定，能较好地保存细胞的微细结构。但操作条件要求较严格，如组织块脱水要彻底，包埋时要注意防潮及防止气泡产生，聚合时温度要控制好等。通常与硬化剂MNA、增塑剂DDSA以及加速剂DMP-30混合使用。2、环氧树脂Epon618：国产，效果不如前者。第37页/共44页超薄切片

1、切片前的准备：铜网清洗，用丙酮和乙醇浸洗

2、支持膜制备：常用Formvar膜聚乙烯醇缩甲醛），由氯仿配置，浓度为0.5%。

3、玻璃刀制备：专用制刀机制作。

4、半薄切片光镜定位。

5、修块技术。

6、超薄切片厚度在50—80nm之间较为合适，干涉色为金黄色为宜。

7、捞片：常用粘捞法和圈捞法。第38页/共44页超薄切片机

分两类：一类是机械推进式切片机，用微动螺旋和微动杠杆来提供微小推进；