第三章核酸化学forgraduatescandidates

第三章核酸化学forgraduatescandidates第一页，共112页。一、核酸的种类和组成单位二、核酸的分子结构DNA的结构(一级、二级、三级结构)RNA的结构（tRNA、mRNA、rRNA）三、核酸的理化性质核酸的一般性质紫外吸收特征变性及复性四、核酸的分离纯化第二页，共112页。

1982年，Cech发现四膜虫的rRNA具有自我剪接的功能。1983-1984，Altman也发现RNA具有催化功能（核酶）。第三页，共112页。1.核酸的种类脱氧核糖核酸（DNA，DeoxyribonucleicAcid）

——多为双链线状，也有单链、环状核糖核酸（RNA，RibonucleicAcid）

——多为单链，分子量比DNA小，包括tRNA（10-15%）、mRNA（5%）、rRNA（80%）

参与蛋白质的生物合成

一、核酸的种类和组成单位第四页，共112页。mRNArRNAtRNA第五页，共112页。2.核酸的组成DNA和RNA是线性多聚核苷酸基本结构单元是核苷酸戊糖：DNA为脱氧核糖，RNA为核糖碱基：DNA（A、T、C、G）RNA（A、U、C、G）第六页，共112页。核酸的组成核酸核苷酸磷酸核苷戊糖碱基水解第七页，共112页。（1）核苷酸①碱基嘌呤碱：腺嘌呤A、鸟嘌呤G嘧啶碱：胸腺嘧啶T、胞嘧啶C、尿嘧啶U稀有碱基第八页，共112页。

嘌呤环

嘧啶环第九页，共112页。第十页，共112页。碱基具有芳香环的结构特征嘌呤环和嘧啶环呈(接近)平面的结构碱基的芳香环与环外基团可以发生：酮式—烯醇式胺式—亚胺式互变异构第十一页，共112页。胺式

亚胺式互变异构第十二页，共112页。酮式烯醇式互变异构第十三页，共112页。鸟嘌呤次黄嘌呤1-甲基次黄嘌呤稀有碱基是基本碱基的化学修饰型第十四页，共112页。第十五页，共112页。②核苷：核糖+碱基第十六页，共112页。核苷nucleoside糖与碱基之间的C-N键：C-N糖苷键。第十七页，共112页。稀有核苷

稀有核苷：2’-0-甲基-核糖-核苷稀有碱基DHU连接方式ψ

（假尿嘧啶核苷）第十八页，共112页。第十九页，共112页。H2OH2O碱基磷酸戊糖核苷键酯键HOCH2③核苷酸第二十页，共112页。核苷酸碱基连接（核苷键）酯键（对DNA为H）1`2`3`4`5`第二十一页，共112页。4.DNA和RNA共有的成分是（）。D–核糖B.D–2-脱氧核糖C.鸟嘌呤D.尿嘧啶E.胸腺嘧啶组成核酸的基本单位是嘌呤碱与嘧啶碱B.核糖与脱氧核糖C.核苷D.核苷酸E.寡核苷酸下列哪种碱基只存在于RNA而不存在于DNA（

）。A.尿嘧啶

B.腺嘌呤

C.胞嘧啶

D.胸腺嘧啶第二十二页，共112页。（2）核苷酸的衍生物①ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸)第二十三页，共112页。ATP的性质能量转换中间体ATP含两个高能磷酸键——水解时释放大量自由能ATP是磷酰化剂GTP(鸟嘌呤核糖核苷三磷酸)主要作为蛋白质合成磷酰基供体第二十四页，共112页。②cAMP和cGMPcAMP

3’,5’环腺嘌呤核苷一磷酸（细胞间信使）

环状磷酯键是高能键第二十五页，共112页。简述ATP在生物体内的主要作用生物系统的能量交换中心（能量货币）参与代谢调节水解放能推动热力学上的不利反应调节代谢路径方向（促进糖酵解、抑制糖异生）细胞内磷酸集团转移的中间载体（NTP、dNTP）合成RNA的原料第二十六页，共112页。二、核酸的分子结构（一）DNA（二）RNA第二十七页，共112页。1、DNA的一级结构——核苷酸的排列顺序核苷酸间以3′-5′磷酸二酯键相连5′-磷酸端（5’-P）和3′-羟基端（3’-OH）多聚核苷酸链具有方向性：表示时需注明方向：5′→3′或3′→5′①特点第二十八页，共112页。脱H2O酯键相连3`，5`-磷酸二酯键首尾3`5`第二十九页，共112页。DNA单链中连接脱氧核苷酸的化学键是()。A.氢键B.

3′-5′磷酸二酯键C.离子键D.

2′-5′磷酸二酯键自然界游离核苷酸中，磷酸最常见是位于()。A．戊糖的C-5′上B．戊糖的C-2′上C．戊糖的C-3′上D．戊糖的C-2′和C-5′上第三十页，共112页。②DNA一级结构的简写形式5`3`首端末端PPPPPP

AGCTGC

OHpApGpCpTpG-pA-G-C-T-G核苷酸顺序又称碱基顺序第三十一页，共112页。2、DNA的高级结构（1）DNA的二级结构（双螺旋结构）碱基互补配对方式：A-T、G-C一股核苷酸序列与另一股序列互补第三十二页，共112页。腺嘌呤胸腺嘧啶鸟嘌呤胞嘧啶第三十三页，共112页。小沟大沟5’3’5’3’第三十四页，共112页。反向平行、右手螺旋碱基位于内侧（碱基平面互相平行、垂直于螺旋轴）两条链依靠碱基间氢键而结合（碱基互补配对）螺旋每周含10个碱基对螺距3.4nm①B型双螺旋特点第三十五页，共112页。根据Watson-Crick模型，求每一微米DNA双螺旋含核苷酸对的平均数为()。A．25400

B．2540

C．29411

D．2941

E．3505关于WatsonandCrickDNA双螺旋模型（）是错的。A.组成双螺旋的两条DNA链反向平行B.碱基对位于双螺旋的内侧C.维系双螺旋结构的作用力主要是碱基堆积力

D.DNA双链是左手螺旋第三十六页，共112页。②双螺旋的补充第三十七页，共112页。B-formhelix（DNA）：获得的条件在较高湿度下（92%）制得基本特性反向平行、右手螺旋、存在情况细胞中DNA主要的二级结构第三十八页，共112页。A-formhelix（DNA）：

获得的条件相对湿度75%以下获得的DNA纤维

基本特性

—右手螺旋

—较B型的DNA宽而短

存在情况

RNA分子的双螺旋区

RNA-DNA杂交双链具有类似结构

第三十九页，共112页。Z-DNA获得的条件人工合成的寡核苷酸基本特性反向平行、左手螺旋磷酸和糖的骨架呈现Z字形（zigzag）走向存在情况嘌呤与嘧啶相间排列的核酸链易出现第四十页，共112页。下列DNA模型中，属于左手的螺旋的是（）。

A.Z-DNAB.C-DNAC.B-DNAD.A-DNA生物体内天然状态的DNA主要是以——存在A.A型

B.B型

C.C型

D.Z型稳定DNA双螺旋结构的主要因素是()。A.氢键和离子键

B.疏水键和范德华力

C.碱基堆积力和氢键

D.离子键和范德华力第四十一页，共112页。③三股螺旋DNA（H-DNA，铰链hingedDNA）寡嘧啶/寡嘌呤核苷酸链第三股碱基与Watson-Crick碱基对中的嘌呤碱形成Hoogsteen配对（中间是嘌呤）第四十二页，共112页。④DNA碱基组成的Chargaff规则具有生物种的特异性与组织/器官来源无关不受生长发育、营养状况及环境条件影响

Chargaff规则碱基摩尔数：A=T、G=CA+C=G+T（含氨基碱基总数=含酮基碱基总数）A+G=C+T

（嘌呤总数=嘧啶总数）

第四十三页，共112页。有二个DNA样品，分别来自两种未确认的细菌。两种DNA样品中的腺嘌呤碱基含量分别占它们DNA总碱基的32％和17％。这两个DNA样品的腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和胸腺嘧啶的相对比例是多少？其中哪一种DNA是取自温泉（64℃）环境下的细菌，哪一种DNA是取自嗜热菌？答案的依据是什么？A:32%T:32%A:17%T:17%36%66%C:18%C:33%第四十四页，共112页。一段双链DNA包含1000个对，其组成中G+C＝58%，那么该双链DNA中T的含量是:

A.58%B.42%C.29%D.21%假尿嘧啶核苷分子中，核糖与嘧啶的连接方式是:

A.C1’-N1B.C1’-N9C.C1’-C2D.C1’-C5

下列关于双链DNA碱基含量关系中（）是错误的。

A.A+G＝C+T

B.A＝T

C.A+T＝G+C

D.C＝G第四十五页，共112页。DNA分子的碱基组成特点是（

）。

A.A/T＝1

B.G+C/A+T＝1

C.G/C＝1

D.A+G/C+T＝1第四十六页，共112页。3.DNA的三级结构（超螺旋）在二级结构基础上经扭曲和折叠形成的

构象（双螺旋的螺旋）第四十七页，共112页。4.DNA与蛋白质的复合体

真核细胞的染色体原核细胞的拟核病毒核糖体第四十八页，共112页。（H2A、H2B、H3、H4）2

第四十九页，共112页。压缩分子第五十页，共112页。RNA和蛋白质核心细菌拟核的突环结构第五十一页，共112页。第五十二页，共112页。真核生物DNA的高级结构包括有（）。A．核小体B．环状DNAC．染色质纤维D．α-螺旋第五十三页，共112页。1.

RNA的一级结构核糖核苷酸通过磷酸二酯键形成的无分支线形长链。（1）RNA一级结构特点①tRNA②mRNA③rRNA第五十四页，共112页。①tRNA分子特点分子较小（70－90个核苷酸）含有较多修饰成分3’端都具有CpCpA-OH结构5’端磷酸化，pG（pC）第五十五页，共112页。5’末端有甲基化的鸟苷酸：帽结构②真核细胞mRNA一级结构特点3’末端有

聚腺苷酸(polyA)：尾结构——转录后经polyA聚合酶作用添加转移半衰期识别稳定性第五十六页，共112页。5’，5’三磷酸桥核糖甲基化核糖甲基化第五十七页，共112页。5’-末端有帽子结构的RNA分子是（）

A.原核生物mRNAB.原核生物rRNAC.真核生物mRNAD.真核生物rRNA真核生物mRNA中5’末端的m’G与第二核苷酸间的

连接方式是（）。

A.5’→2’B.5’→3’C.3’→5’D.5’→5’大部分真核细胞mRNA的3′-末端都具有：A．多聚AB．多聚UC．多聚TD．多聚CE．多聚G第五十八页，共112页。寡聚dT-纤维素柱层析用于（

）。A.从总DNA中分离纯化质粒DNAB.从总核蛋白中分离出DNPC.从总RNA中纯化mRNAD.除去杂蛋白tRNA分子二级结构的特征是()。A.3端有多聚AB．5端有C-C-AC.有反密码子环D.有氨基酸残基E.尿嘧啶环第五十九页，共112页。关于RNA分子中“尾”的正确叙述是()。A.是tRNA的加工过程B.存在于tRNA的3末端C.是由多聚腺苷酸(polyA)组成D.存在于真核细胞的mRNA上mRNA的特点有：A．分子大小不均一B．有3′-多聚腺苷酸尾C．有编码区D．有5′C-C-A结构第六十页，共112页。③rRNA一级结构特点70S80S第六十一页，共112页。真核细胞核糖体的沉降系数是

A．50S

B．60S

C．70S

D．80S

各类核糖核酸中,稀有核苷酸含量百分比最高的是

A.tRNA

B.5srRNA

C.mRNAD、rRNA有关RNA的描写哪项是错误的（）。A．mRNA分子中含有遗传密码B．tRNA是分子量最小的一种RNAC．胞浆中只有mRNAD．组成核糖体的主要是rRNA第六十二页，共112页。借助次级键进而折叠（三级结构）2.RNA的高级结构RNA通常是单链线形分子——自身回折形成局部双螺旋（二级结构）

除tRNA多数成核蛋白复合物（四级结构）如核糖体、拼接体、编辑体（RNP）

A-UG-CtRNA的二级和三级结构第六十三页，共112页。①

tRNA的三叶草结构（二级结构）氨基酸臂DHU环反密码环额外环TΨC环末端CCA-OH接受活化AA识别密码子分类的重要指标第六十四页，共112页。②tRNA的倒L型结构（三级结构）DHU环第六十五页，共112页。决定tRNA携带氨基酸特异性的关键部位是：

A.3′末端B.TψC环C.DHU环D.额外环E.反密码子环

tRNA的二级结构为（）。双螺旋B.超螺旋C.线形D.三叶草形E.倒“L”形有关RNA结构的叙述哪项是正确的？A.通常以双链分子存在B.通常以环状单链分子存在C.通常以单股链存在，可有局部双链结构D.RNA的空间构象为超螺旋结构第六十六页，共112页。核酸的组成和在细胞内的分布如何?核酸由DNA和RNA组成在真核细胞中，DNA主要分布于细胞核内…另外叶绿体、线粒体和质粒中也有DNARNA主要分布在细胞核和细胞质中另外叶绿体和线粒体中也有RNA第六十七页，共112页。三、核酸的理化性质（一）核酸的一般性质1.核酸的水解2.核酸的酸碱性质酸、碱、酶

DNA/RNA对酸碱耐受程度不同第六十八页，共112页。第六十九页，共112页。①酸水解（完全水解）糖苷键比磷酸酯键更敏感嘌呤碱比嘧啶碱的糖苷键更不稳定对酸最不稳定的——嘌呤与脱氧核糖间糖苷键1.核酸的水解第七十页，共112页。DNA在pH2.8、100℃加热1h，可除去嘌呤形成无嘌呤酸（apurinicacid，APA）第七十一页，共112页。2’/3’环磷酸酯2’核苷酸3’核苷酸②碱水解

RNA磷酸酯键比DNA的更敏感（0.3M-1M）第七十二页，共112页。③酶水解（主要作用于磷酸二酯键）根据底物：DNase、RNase根据作用方式：核酸外切酶、核酸内切酶底物二级结构：双链酶、单链酶作用的化学键：磷酸二酯酶、磷酸单酯酶非特异性/碱基特异的N－糖苷酶水解糖苷键第七十三页，共112页。5’-T-A-G-C-T-A-T-A-G-C-T-A-3’3’-A-T-C-G-A-T-A-T-C-G-A-T-5’5’-T-A-G-C-T-A--T-A-G-C-T-A-3’3’-A-T-C-G-A-T--A-T-C-G-A-T-5’5’-T-A-G-C-T-A-T-A-G-C-T-A-3’3’-A-T-C-G-A-T-A-T-C-G-A-T-5’限制性内切酶(细菌)具严格的碱基序列专一性平末端粘末端第七十四页，共112页。核苷酸是两性电解质2.核酸的酸碱性质DNA等电点为4～4.5RNA等电点为2～2.5第七十五页，共112页。

碱基含有共轭双键紫外吸收光谱：260nm核酸及其组份定量的依据（二）核酸的紫外吸收特征通常A260为1相当于：50μg/mL双螺旋DNA40μg/mL单链DNA（或RNA）20μg/mL寡核苷酸

第七十六页，共112页。

核酸具有紫外吸收能力的原因是（）。A.嘌呤和嘧啶环中有共轭双键B.嘌呤和嘧啶中有酮基C.嘌呤和嘧啶中有氨基

D.嘌呤和嘧啶连接了核糖

E.嘌呤和嘧啶连接了磷酸基团第七十七页，共112页。1、核酸的变性①实质：

某些理化因素使碱基对的氢键断裂，核酸分子高级结构改变、理化性质及生物活性发生改变。不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变（三）核酸的变性与复性降解：核苷酸骨架上3’，5’-磷酸二酯键的断裂第七十八页，共112页。②变性因素

高温（一般＞75℃）—热变性强酸、碱—

酸碱变性甲醛（Agarose中RNA）尿素（PAGE中DNA）机理：双链间氢键断开，消除二级结构第七十九页，共112页。③增色效应核酸降解或完全变性后紫外吸收值增加：天然DNA↑25-40%、RNA↑约1.1%实质：碱基暴露RNA变性引起的性质变化没有DNA明显第八十页，共112页。④DNA热变性的特征变性过程是“跃变”而非渐变加热变性使DNA双螺旋结构失去一半所需的温度称为融点/熔解温度（Tm）指增色效应达50%时的温度一般DNATm值在85-90C之间第八十一页，共112页。

Tm值大小与下列因素有关：DNA的均一性：越均一Tm的范围愈小G－C含量：越高Tm越高

介质的离子强度：愈高Tm愈高

不易用稀电解质保存DNA第八十二页，共112页。

DNA在纯水室温下放置时，为什么线状双链DNA会分离成它的组成链？失去阳离子的稳定作用、DNA的解链温度Tm降低下列哪些物质能降低双链DNA的Tm值？SSB、核组蛋白、氯化钠、甲酰胺、碱SSB：单链结合蛋白甲酰胺：强烈的氢键竞争者碱：增加碱基电荷第八十三页，共112页。影响Tm值的因素有（）。A.一定条件下核酸分子越长，Tm值越大B.DNA中G，C对含量高，则Tm值高C.溶液离子强度高，则Tm值高D.DNA中A，T含量高，则Tm值高第八十四页，共112页。2.核酸的复性变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的单链重新缔合成双链热变性DNA骤然冷却（淬火）不能复性将变性DNA缓慢冷却（退火）可以复性减色效应（低色效应）——复性时紫外吸收减少第八十五页，共112页。分子量：越大，复性越难浓度：越大，复性越容易本身组成和结构：具多重复序列DNA复性快

影响复性程度与速率的因素第八十六页，共112页。DNA变性时()断裂，变性后紫外吸收会()。A.离子键，降低

B.离子键，增强

C.分子键，降低

D.氢键，增强

DNA变性是指（）。A．分子中磷酸二酯键断裂B．多核苷酸链解聚C．DNA分子由超螺旋→双链双螺旋D．互补碱基之间氢键断裂E．DNA分子中碱基丢失第八十七页，共112页。DNATm值较高是由于哪组核苷酸含量较高所致？A．G+AB．C+GC．A+TD．C+TE．A+CDNA变性后，下列那一项变化是正确的?A.对260nm紫外吸收减少B.溶液粘度下降C.磷酸二酯键断裂D.核苷键断裂E.嘌吟环破裂DNA复性的重要标志是()。A.溶解度降低B.溶液粘度降低C.紫外吸收增大D.紫外吸收降低第八十八页，共112页。下列各DNA分子中，碱基组成比例各不相同，其中那种DNA的Tm最低（）。A.A-T占15%B.G-C占25%C.G-C占40%D.A-T占80%E.G-C占35%由结核分枝杆菌提纯出含有15.1％（按摩尔计算）的腺嘌呤的DNA样品，计算其它碱基的百分含量。A=T=15.1%；G=C=34.9%第八十九页，共112页。下列三种DNA中，哪个的Tm值最高？哪个的Tm值最低？为什么？A.AAGTTCTCTGAATTATTCAAGAGACTTAATB.AGTCGTCAATGCATTTCAGCAGTTACGTAAC.GGATCTCCAAGTCATCCTAGAGGTTCAGTA将下列DNA分子加热变性，再在各自的最适温度下复性，哪种DNA复性形成原来结构的可能性更大？为什么？A.ATATATATATB.TAGACGATGCTATATATATAATCTGCTACG第九十页，共112页。不同来源的DNA经热变性后缓慢冷却异源DNA间如存在互补序列复性时会交错配对形成杂交DNA分子3.核酸的杂交

Southern杂交（DNA）

Northern杂交（RNA）

Western杂交(Pr)第九十一页，共112页。四、核酸的分离纯化1.核酸的超速离心利用核酸MW、密度和构象的差异进行分离蔗糖/甘油/浮力密度梯度离心2.核酸的凝胶电泳琼脂糖、PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）不同构象的DNA分子迁移率不同超螺旋＞线状分子＞开环状分子溴化乙锭、硝酸银第九十二页，共112页。3.核酸的柱层析羟基磷灰石柱层析层析——用于分子杂交种单链和双链的分离吸附能力强Oligo(dT)寡聚脱氧胸苷酸亲和层析——分离mRNA第九十三页，共112页。4.DNA的提取与纯化苯酚：蛋白质的变性剂乙醇：沉淀DNA蛋白酶K：降解细胞蛋白SDS：裂解细胞水：溶解DNA（不溶于0.14MNaCl）DNA与碱性蛋白质形成核蛋白DNPDNP溶于水和浓盐溶液（1MNaCl）破碎第九十四页，共112页。5.RNA的提取与纯化DEPC(焦碳酸二乙酯)：破坏RNase①酸性胍盐+苯酚+氯仿抽提异硫氰酸胍使蛋白质变性②胍盐/氯化铯将细胞抽提物密度梯度离心上层蛋白、中间DNA、底部RNA第九十五页，共112页。防止降解和变性条件温和、防止过酸/碱、避免剧烈搅拌防止核酸酶作用第九十六页，共112页。一单链DNA与一单链RNA分子量相同，如何区分？专一性的DNA酶与RNA酶碱水解：RNA易被水解颜色反应：兰色…绿色…利用单核苷酸分析：U、T第九十七页，共112页。6.核酸及其组分含量的测定（1）紫外吸收法（260nm）（2）定糖法RNA：核糖→糠醛→→绿色物质（670-680nm）DNA：脱氧核糖+二苯胺→兰色物质（595-620nm）

苔黑酚地衣酚浓HCl浓硫酸第九十八页，共112页。（4）琼脂糖凝胶电泳溴乙锭能插入DNA分子碱基间形成复合物紫外线照射下荧光强度与DNA含量成正比（3）定磷法核酸含磷量为9.5%（1g磷相当于10.5g核酸）橘红色第九十九页，共112页。核酸纯度的测定通常用A260/A280=1.8-2.0作为纯度标准纯DNA比值1.8，＜1.8Pr污染纯RNA比值2.0，＞2.0RNA污染第一百页，共112页。OD260的应用

DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于：50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸判断核酸样品的纯度（OD260/OD280

）DNA纯品:1.8；RNA纯品:2.0判断DNA是否变性变性（增色效应）；复性（减色效应）第一百零一页，共112页。从动植物细胞匀浆中提取基因组DNA时，常用EDTA、氯仿-异戊醇混合液和95%乙醇试剂。请根据蛋白质和核酸理化性质回答：（1）该实验中这些试剂各起什么作用？（2）举出一种可以鉴定所提取基因组的DNA中是否残

留有RNA的方法。EDTA：络合金属离子（核酸酶的作用…）氯仿-异戊醇：去蛋白、去苯酚95%乙醇：沉淀DNA鉴定核糖、用专一性的核酸酶第一百零二页，共112页。在分离和鉴定动物肝DNA和RNA的实验中，下列化合物的作用是什么？A.0.1MNaClB.

5MNaClC.0.1MNa2-EDTA溶液D.15％SDS溶液E.氯仿--异戊醇（24:1溶液）不同浓度的NaCl溶液中DNA和RNA溶解度不同在0.1MNaCl

溶液中RNA溶解而DNA溶解度低，在5MNaCl中DNA的溶解度大于RNASDS（十二烷基硫酸钠）、EDTA为核酸酶抑制剂EDTA：将核酸酶的激活剂Mg2+络合SDS:可使核蛋白体解离，使蛋白质变性氯仿--异戊醇使蛋白质变性第一百零三页，共112页。可用于测量生物样品中核酸含量的元素是()。A．碳B．氢C．氧D．磷E．氮核酸对紫外线的最大吸收峰在哪一波长附近？A．280nmB．260nmC．200nmD．340nm在核酸结构中含量较稳定的元素是A.CB.HC.OD.NE.P关于核酸的叙述，正确的有（

）。A.是生物大分