微生物学课件

第七章

微生物的遗传和变异1掌握微生物遗传、变异的物质基础掌握基因突变、基因重组的机制和方式熟悉菌种选育和保藏的基本理论、方法熟悉质粒的基本特征及医学上重要的质粒本章要求2遗传（heredity）—亲代将遗传信息传递给子代，使子代获得与亲代相似的性状（形态、结构、代谢、毒力等）变异（variation）—子代与亲代相比，性状发生改变遗传是相对的，变异是绝对的—适应新环境3第一节微生物的变异现象菌体形态、结构变异毒力变异菌落形态变异酶活力的变异5菌体形态结构变异

青霉素、溶菌酶

正常形态细菌──────→L型变异

(部分或完全失去胞壁)

正常霍乱弧菌霍乱弧菌L型6毒力变异

β-温和噬菌体

白喉棒状杆菌────→获得白喉毒素7菌落变异

光滑型菌落─────→粗糙型菌落

S

R

失去LPS的特异性多糖重复单位诱导酶的形成eg：与乳糖代谢有关的酶在陈旧培养基中长期培养或在有免疫力的人体内酶活力变异8转化（transformation）实验

10活R菌加S菌的DNA加S菌的DNA及DNA酶以外的酶加S菌的DNA及DNA酶加S菌的RNA加S菌的蛋白质加S菌的荚膜多糖长出S菌只长R菌证明转化因子是DNA的细菌实验112、感染3、两种沉淀细胞进一步培养后，均可产生大量完整的子代噬菌体证明噬菌体的遗传物质是DNA（三）TMV病毒粒子的重建实验TMV：植物病毒，ssRNA32P－phageE.coli（正常培养基）离心沉淀中有放射性

35S－phageE.coli

E.coli

离心上清液中有放射性吸附使蛋白质外壳与E.coli分离外壳吸附131、TMV因为RNA是裸露的，所以感染频率较低2、HRV霍氏车前花叶病毒花叶症状TMVTMVHRV花叶花叶HRVTMV拆开重建感染分离纯化苯酚振荡感染烟草分离纯化所以，遗传物质是核酸，而非蛋白质14二、微生物的遗传物质（一）真核微生物的遗传物质化学组成：线状dsDNA和蛋白质（sp：组蛋白）存在形式：染色质（分裂间期）；染色体（分裂期）结构单位：核小体（200bp的DNA和5种组蛋白组成）（二）原核生物的遗传物质细菌、放线菌

DNA实质是一条双链、高度折叠盘绕的大分子（三）病毒和噬菌体的遗传物质除朊病毒外，已知的均为裸露的DNA或RNA（ds、ss）15（三）医学上重要的质粒1、F因子（致育因子fertility)编码细菌性菌毛，有F因子的为F＋菌株，可通过接合的方式转移2、R质粒（抗药质粒）编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性。分类：根据能否借接合而转移分1）接合型耐药质粒抗药决定因子（r-det）：决定耐药性，可同时携带多种抗药基因抗药转移因子（RTF）：决定转移性

2）非接合型耐药质粒（r因子）：只有抗药决定因子（r-det）17耐药机制：

1）产生顿挫酶破坏抗菌作用的酶eg：β－内酰胺酶，可水解β－内酰胺类抗生素的内酰胺环—抗生素失活2）改变细胞膜通透性使药物无法进入细胞内而无法发挥作用3）改变药物的原始作用点eg：R因子使细菌核糖体30S亚基发生变化，链霉素不能与之结合，因此不能发挥抗菌作用3、Col质粒编码大肠菌素（colicin）的质粒大肠菌素（colicin）:是一类可使没有Col质粒的而亲缘关系密切的菌株死亡的蛋白质4、V质粒：编码肠道细菌毒力18第三节基因突变一、基因突变的概念突变（mutation）：DNA结构（种类、排列方式）的改变，导致其控制的性状发生改变突变体（mutant）：具有突变型的细胞或个体二、基因突变的来源根据引起突变的原因分1、自发突变（sportaneousmutation）在外界自然条件下发生的DNA结构改变。突变率：10-9～10-6包括基因突变：又称为点突变，指DNA局部结构发生改变染色体畸变：大段DNA结构发生改变，常导致菌体死亡自发突变诱发突变19按诱变剂是直接还是间接引起置换，分别讨论置换机制1、直接引起置换的诱变剂eg：亚硝酸、羟胺、烷化剂（部分可引起颠换）以亚硝酸为例说明诱变机制：亚硝酸可使碱基发生氧化脱氨作用，结果AH，CUH烯醇式：与C配对酮式：与T配对ATHNO2HT酮式ATHC烯醇式GCHT酮式212、间接引起置换的诱变剂（DNA复制时掺入）诱变剂均为碱基类似物eg：5－BU（5－溴尿嘧啶），5－AU（5－氨基尿嘧啶），8－NG（8－氮鸟嘌呤）等以5－BU为例：5－BU酮式：与A配对烯醇式：与G配对当微生物培养液中含有5－BU时，细胞内有一部分新合成的DNA的T被5－BU取代AT5-BUA5-BU酮式ATG5-BU烯醇式GCA5-BU酮式碱基类似物只对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才有作用，而对静止细胞、离体DNA没有作用22（二）嵌合剂和移码突变移码突变（frame-shiftmutation）:指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸插入或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变eg：丫啶类染料，包括丫啶橙、核黄素、丫啶黄、

α－氨基丫啶等23（三）辐射诱变

包括UV、X-射线、激光、离子束等1、UV的诱变机制条件：波长254nm，强度15W，距离30cm左右，t不定（10s～2min）机制：形成胸腺嘧啶二聚体（TT）

UV的修复：1）光复活作用：T=TT+T2）SOS修复：应急差错修复，使突变率增加

可见光光复活酶252、电离辐射的诱变作用X－射线、γ－射线

X－射线作用机制：1）直接作用：DNA双螺旋氢键的断裂，DNA单链的断裂，DNA双链之间的交联等2）间接作用a：使细胞内产生过氧化氢及自由基—诱变剂b：使细胞内产生碱基类似物—诱变剂3、激光诱变He-Ne激光26ConjugationTransformationTransduction29一、转化转化现象最早发现于肺炎球菌中转化（transformation）:受体细胞直接从周围环境中吸收比较大的游离的DNA片段，并整合于受体细胞的基因组中从而使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象。转染（transfection）:若病毒或噬菌体的DNA转化感受态的受体细胞，产生正常的子代病毒或噬菌体的转化方式。30（一）转化的前提条件1、感受态细胞并非所有的细胞都可以吸收DNA，只有在某一条件下培养的部分细胞才有吸收DNA的能力。将有这种能力的细胞称为感受态细胞。

感受态：能接受转化作用的细胞的生理状态感受态影响因素：菌种、培养时间、菌龄等。2、转化DNA

dsDNA，分子量106～108道尔顿。31转化过程32（二）自然转化的过程与机制以肺炎球菌为例:1、转化因子（dsDNA）的结合与吸收1）细胞表面的结合dsDNA与受体细胞表面相结合特点：特异性、不可逆性2）转化因子的吸收降解产生能量协助把ssDNA推进受体细胞。结合后的dsDNA107Dr片段ssDNA核酸内切酶核酸外切酶332、转化因子的整合

ssDNA以被保护的形式被转运到受体细胞染色体同源区段，发生基因置换式重组。3、转化子的产生途径：1）通过错配修复，将不配对的受体菌碱基切除再经修复合成后形成转化子。若切除的是不配对的供体碱基则不产生转化子。2）杂合双链分子直接发生染色体复制，再经细胞分裂在部分子代细胞中出现转化子。34Bacterialconjugation(mating)isaprocessofgenetictransferthatinvolvescell-to-cellcontact.接合（Conjugation）35二、接合（一）接合的概念

接合（conjugation）—在供体菌与受体菌直接接触时，通过性菌毛的作用，遗传物质从供体菌转移至受体菌内的转移方式。接合是原核微生物中应用最广泛的一种遗传物质转移方式能发生结合作用的细菌多是G-。接合作用与供体菌中所含的接合因子有关。36以E.coli中F因子的接合作用为例说明：根据细胞中是否存在有F因子及其存在方式的不同，将E.coli分为四种菌株：

1、F＋菌株细胞内有游离的F因子，控制性菌毛的生成及自身的接合转移。

2、F－菌株细胞内无F因子，表面没有性菌毛。37383、Hfr（高频重组）菌株

细胞内F因子整合到宿主染色体上，随染色体的复制而复制，但仍有编码性菌毛及接合转移的能力。。4、F’菌株—携带F’因子的菌株

F’因子－带有宿主染色体基因的特殊F因子。Hfr菌株中，F因子可以从染色体上切离下来，Hfr菌株变为F＋菌株；当不正常切离时，成为F’因子。39

F因子的存在方式及相互关系40

（二）接合的机制1、F＋与F－接合1）胞质桥的形成

性菌毛连接细胞后，使细胞紧密接触，接触处形成胞质桥—F因子的转移通道2）DNA的转移

ssDNA进入受体细胞后，两端相连形成环状DNA分子，复制形成dsDNA分子—F因子，最终所以F＋X

F－2F＋。3）分离两个F＋细胞的分离。41

F+×F－杂交42

2、Hfr与F－的接合过程同F＋与F－的接合遗传物质的转移顺序：

OriT-小段F因子-染色体-大段F因子全部染色体DNA转入F－菌约需100min，该过程中易受环境影响而中断，因此只有一小部分F因子转移入F－中。3、F’与F－的接合过程同F＋与F－的接合，结果

F’F－2F’。X43Hfr菌株染色体基因转移4445三、转导（transduction）转导：以噬菌体为媒介，将供体菌的遗传物质转移入受体菌，通过基因重组而使受体菌获得供体菌的部分遗传性状。转导子（transductant）

通过转导获得新的遗传性状的受体菌，所用噬菌体均为缺陷型噬菌体（包括温和、烈性噬菌体）转导普遍性转导局限性转导完全转导流产转导46通过完全缺陷的噬菌体将供体菌的任何DNA片段转移至受体菌的现象分类：1、完全转导（completetransduction）噬菌体：温和或烈性噬菌体噬菌体的DNA装配入衣壳中时，偶尔出现装配错误，装入与噬菌体DNA大小相似的供体菌DNA片段，形成转导噬菌体。当供体细胞裂解后，释放出极少的转导噬菌体，感染其他受体菌后，通过交换重组，供体菌基因整合入受体菌基因组，形成重组子，即转导子—遗传性状稳定，是完全转导（一）普遍性转导（generaltransduction）472、流产转导（abortivetransduction）

经转导获得供体菌DNA片段的受体菌，若外源DNA在细胞内不能整合入受体基因组并复制，也不迅速消失，而仅能表达，该现象称为流产转导

在选择培养基上形成微小菌落48普遍性转导49（二）局限性转导（restrictedtransduction）噬菌体：温和噬菌体

50theDNAoflambdaisinsertedintothehostDNAatthesiteadjacenttothegalactosegenesOninduction,Underrareconditions,thephagegenomeisexcisedincorrectly

AportionofhostDNAisexchangedforphageDNA,calledlambdadgal(dgalmeans"defectivegalactose“)PhagesynthesisiscompletedCelllysesandreleasesdefectivephagecapableoftransducinggalactosegenesSpecializedTransduction(λphage)51普遍性转导与局限性转导的区别区别要点普遍性转导局限性转导基因转导发生的时期裂解期溶原期转导的遗传物质供体菌染色体DNA任何部位或质粒噬菌体DNA及供体菌DNA的特定部位转导的后果完全转导或流产转导受体菌获得供体菌DNA特定部位的遗传特性转导频率受体菌的10-7转导频率较普遍转导增加1000倍(10-4)52（三）溶原性转换溶原性转换是当噬菌体感染细菌时，宿主菌染色体中获得了噬菌体的DNA片段，使其成为溶原状态时而致细菌获得新的性状。白喉棒状杆菌与转导的区别：噬菌体不携带外源基因噬菌体不是缺陷型的不形成转导子宿主获得的形状随噬菌体的消失而消失53原生质体融合（protopastfusion)原生质体融合是将两种不同的菌经溶菌酶或青霉素等处理，失去细胞壁成为原生质体后进行彼此融合的过程。聚乙二醇可促使二种原生质体的融合。原生质体融合是一种人工基因转移系统，本质上与基因转移无关或关系很小。54原生质体融合（protopastfusion)55第五节微生物遗传学的应用一、菌种选育指应用微生物遗传变异的理论，在微生物群体中选出所需性状菌种的过程。目的：提高产量、改进菌种质量途径：自然选育、诱变育种、杂交育种56（一）自然选育利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程eg：

1、从污染噬菌体的发酵液中分离抗噬菌体的菌株。

2、酒精工业中，从产黑色孢子的宇佐美曲霉3758号菌株分离到一株分生孢子为白色的糖化菌种，糖化力增强，培养条件更粗放。自发突变率低，一般10－9～10－6，正变率更低，所以获得优良菌种的可能性极低诱变育种（突变率提高10～上万倍）。57正向变异：生产中菌种产量增加的变异负向变异：生产中菌种产量降低的变异（二）诱变育种

利用物理、化学或生物诱变剂，促使微生物发生突变，再采用一定的筛选方法，从中挑选出少数符合育种目的的突变株优点：操作简便，突变率高，周期短缺点：缺少定向性（随机性大）过程：出发菌株的制备，诱变处理，筛选目的菌株581、出发菌株的制备选优良的出发菌株：要求：A、纯种，单细胞或单孢子悬液B、对诱变剂敏感：一些菌发生某一变异后，会提高对其它诱变因素的敏感性C、具有优良性状避免长出不纯菌落分散态的细胞可均匀地接触诱变剂生长速度快营养要求低产孢子早而多2、诱变处理选择合适的诱变剂、合适的剂量、合适的中止方法（预实验）593、筛选突变株

基因突变的类型很多，诱变处理后，会出现各种突变株以营养缺陷型突变株的筛选为例，说明筛选过程：1）所需培养基A、基本培养基（MM)－仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低组合培养基不同的微生物MM不同，有的极复杂（如乳酸菌的培养基），有的极简单（如E.coli’sMM）。并非所有的基本培养基都不含有生长因子。60B、完全培养基（CM）－可满足各种营养缺陷型菌株生长需要的培养基。一般是在MM中加入一些富含氨基酸、维生素和碱基之类的天然物质（eg：蛋白胨、酵母膏等）配制而成C、补充培养基（SM）－在MM中加入某种微生物的营养缺陷型菌株所不能合成的代谢物所配制的培养基612）与营养缺陷型有关的三类遗传型个体A：野生型－从自然界中分离得到的发生营养缺陷突变前的原始菌株B：营养缺陷型－野生型菌株诱变处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株C:原养型－营养缺陷型突变株经回复突变或重组后形成的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同623）筛选过程

诱变剂处理（同一般诱变方法）

淘汰野生型（处理后营养缺陷型的比例一般较低，所以要淘汰野生型）方法：

抗生素法、菌丝过滤法631、抗生素法

a：青霉素法－适用于细菌

原理：青霉素能抑制细菌细胞壁的合成，因此可杀死处于生长繁殖期的细菌，而不能杀死静止状态的细菌。

方法：将诱变后的细菌培养在含青霉素的MM中，杀死大部分生长繁殖活跃的野生型菌株，从而达到“浓缩”营养缺陷型细胞的目的。b：制霉菌素法－适用于真菌

原理：制霉菌素属于大环内酯类抗生素，可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起细胞膜的损伤。只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌，所以可以达到淘汰野生型的目的。642、菌丝过滤法－适用于丝状真菌或放线菌

原理：MM中野生型的孢子能发芽长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。

方法：将诱变后的孢子在MM中培养一段时间后，再用擦镜纸等合适滤纸过滤。重复数次后，可除去大部分野生型个体，达到“浓缩”的目的。65C：营养缺陷型的检出多数营养缺陷型在CM培养基上生长时，菌落形态和野生型没有明显区别，所以需要检出。方法：在同一培养皿中检出：夹层培养法，限量补充培养法在不同培养皿检出：逐个检出法，影印接种法66夹层培养法：培养皿中先倒一薄层无菌的MM培养基，冷凝后倒上一层混有经诱变处理的菌液的培养基，其上再倒一薄层无菌的MM培养基，成为“三明治”状。培养后，对首次出现的菌落作标记；最后再在皿内倒上一薄层第四层培养基－CM，再培养后出现的形态较小的新菌落，多数是营养缺陷型。限量补充培养法：把诱变处理后的细胞接种在含有微量（0.01%以下）蛋白胨的MM上，野生型生长快，菌落大，而缺陷型菌落小，若想得到某一特定缺陷型菌株，可直接在MM上加入微量的相应物质。67逐个检出法：将诱变后的细胞涂在CM培养基上，长成单菌落后，用接种针或无菌牙签把单菌落逐个依次点种于MM及CM培养基上。培养后，在CM某位置生长而MM相应位置上不生长的是营养缺陷型。影印法：将诱变后的细胞涂布于CM上，培养得到单菌落，用无菌影印装置把此皿上的菌落转印到另一MM上，培养后比较两平板，CM上有而MM上没有的即为营养缺陷型。68影印培养694）营养缺陷型的鉴定方法：生长谱法（auxanography）步骤：a：菌悬液或单孢子悬液的制备把生长在CM上的营养缺陷型细胞或孢子用无菌水洗下，经无菌水洗涤离心（除CM），制备成浓度为107～108个/ml的悬液b：制备混菌平板

取0.1ml与冷却到50℃左右的MM混合均匀，倒于平皿中70c：分区加营养物质培养基凝固后，在皿背划分为若干区域，在正面加微量的氨基酸、维生素、碱基等的粉末或结晶（也可用滤纸片法）d：检出培养后，某一营养物周围有微生物的生长圈，说明它是该营养物的营养缺陷型71杂交：细胞水平上的一种基因重组杂交育种：两个不同基因型的菌株通过一定的方式使遗传物质重新组合，从中分离和筛选出具有新性状的菌株育种方法如接合、转化、转导（原核生物）；有性、准性生殖（真核生物）；原生质体融合等用途：1、改变菌株的遗传物质，获得杂种菌株2、集中不同菌株的优良性状3、扩大变异范围，创造新品种（三）杂交育种72二、基因工程（geneengineering）

在诱变育种及分子遗传学的基础上，出现的一个人为控制的育种新领域。基因工程：在各种酶的作用下，将目的基因的DNA分子与载体DNA分子相连接，形成重组的DNA分子，以一定的方式导入原无该类分子的宿主细胞，并使宿主生物变为自然界原来没有并能连续传代的新生物。工程菌：经基因工程改造后的菌株7374（一）基因工程的基本操作1．分离目的基因的DNA片段。2．目的基因与有选择标记的载体形成重组分子。3．将重组分子导入受体细胞。4．筛选重组转化子（抗性、酶切、杂交、PCR、测序）。75载体须具备的条件：有自主复制能力较高的复制率最好只有一个限制性核酸内切酶切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA