生物药物的分离纯化

生物药物的分离纯化第1页/共51页主要讲授内容1.生物药物原料的选择、预处理与保存方法2.生物药物的提取3.蛋白质类药物的分离纯化方法4.核酸类药物的分离纯化方法第2页/共51页5.糖类药物的分离纯化方法6.脂类药物的分离纯化方法7.氨基酸类药物的分离纯化方法第3页/共51页1.1生物药物原料的选择生物药物生产原料的选择原则主要是：(1)有效成分含量高，原料新鲜；(2)原料来源丰富，易得，原料产地较近；(3)原料中杂质含量少；(4)原料成本低等。但是，同时具备这4种有利因素的原料不多，生产研究者可酌情选择，但第一条是最重要的。第4页/共51页原料的选择还要注意如下事项：植物原料要注意植物生长的季节性，选择最佳采集时间；微生物原料要注意微生物生长的对数期长短；动物原料有的要注意动物的类别、年龄与性别。也应注意原料的采集地和批次。第5页/共51页1.2原料的预处理与保存

动物原料采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存；植物原料确定后，要择时采集并就地除去没有用的部分，将有用部分保鲜处理；收集微生物原料时，要及时将菌体细胞与培养液分开，进行保鲜处理。第6页/共51页原料的保存方法主要有：①冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用-40℃速冻。②有机溶剂脱水法。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。③防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。第7页/共51页2.生物药物的提取

(1)生物组织与细胞的破碎

(2)生物组织细胞破碎后立即进行提取第8页/共51页生物组织与细胞的破碎

生物药物大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，对生物组织与细胞的破碎过程是非常重要的。第9页/共51页常用的破碎方法有5种：A.磨切法，该法属于机械破碎方法，使用的设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等。B.压力法，这类方法有加压与减压两种，常用的法兰西压釜使用效果良好。第10页/共51页C.反复冻融法，该方法设备简便，活性保持好，但用时较长。D.超声波振荡破碎法，该方法破碎效果较好，但由于局部发热，对活性有损失。E.自溶法或酶解法，用得较少。第11页/共51页生物组织活性物质的提取要在细胞破碎后立即进行。提取过程中（1）要根据活性物质的性质，选择提取试剂。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂(如氯仿、丙酮等)。第12页/共51页（2）考虑提取溶剂的用量（料液比）及提取次数、提取时间。（3）注意提取的温度、pH、变性剂等因素。这样才可以保证活性物质提取充分而且不变性。第13页/共51页3.蛋白质类药物的分离纯化方法蛋白质类药物主要包括蛋白质、多肽和酶类等药物。它们的分离纯化方法有：(1)沉淀法(2)按分子大小分离的方法(3)按分子所带电荷进行分离的方法(4)亲和层析法第14页/共51页(1)沉淀法

蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。该法的原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、与靶物质结合沉淀法(如抗体一抗原)等。第15页/共51页(2)按分子大小分离的方法

这类方法有超滤法和透析法(即膜分离方法)、凝胶层析法、超速离心法等。其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。第16页/共51页

(3)按分子所带电荷进行分离的方法

氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它们具有等电点，在离开等电点的pH时便会带正或负电荷。例如某蛋白质等电点为7.0，当溶液pH为4.0时，分子则带有正电荷。由于具有该性质，利用带电性质进行分离是极其有效的方法。第17页/共51页

利用蛋白质带电性质行分离的方法有：离子交换柱层析法；电泳法；等电聚焦法。第18页/共51页（4）亲和层析法

大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物(或抑制剂)、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。第19页/共51页亲和层析法主要包括：疏水反应层析、金属螯合层析、免疫亲和层析、共价亲和层析、固定化染料亲和层析、特殊基团亲和层析等。亲和层析技术大量应用于蛋白质分离和纯化。第20页/共51页4.核酸类药物的分离纯化方法核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法。提取法生产DNA和RNA的主要技术是，先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离RNA与DNA。发酵法主要用于生产单核苷酸。第21页/共51页5．糖类药物的分离纯化方法由于各种糖类药物的性质和原料来源不同，没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只介绍多糖和粘多糖的一般分离纯化方法。第22页/共51页提取方法

非降解法：适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。第23页/共51页降解法：适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖。例如从软骨中分离提取硫酸软骨素，就是用碱处理进行降解，又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。第24页/共51页(2)分离方法常用的分离纯化多糖的方法是乙醇沉淀法和离子交换层析法。第25页/共51页乙醇沉淀法是从提取液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于分级分离。用4～5倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。季铵化合物也可用于沉淀粘多糖,其原理是粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基铵(CTA)等。第26页/共51页离子交换层析法：粘多糖的聚阴离子能够很好地被阴离子交换剂吸附和分离，如Dowex-I-X2离子交换树脂、DEAE-离子交换纤维素*等。洗脱可用NaCl溶液进行梯度洗脱。注意从粗多糖中除去蛋白常用的方法有：Sevag法、三氯乙酸法和蛋白酶解法。*二乙氨基乙基纤维素第27页/共51页6.脂类药物的分离纯化方法

(1)提取方法脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极性脂是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合的。因此，提取脂质药物就是要选择适当的溶剂来破坏这种结合键，将脂质溶解出来。常用的溶剂有组合溶剂，醇是其中的主要成分，此外还有氯仿、甲醇、水等。第28页/共51页

(2)纯化方法沉淀法：由于不同脂质在丙酮中溶解度不同，故常用它进行沉淀。吸附层析法：常用吸附剂有硅胶、氧化铝等。它是通过极性和离子键力等把各种化合物结合到固体吸附剂上。一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非极性组分先流出，极性组分后流出。第29页/共51页离子交换层析法：脂质分子的存在有非解离和酸式解离两种状态。根据它们在一定pH条件下的解离情况，选择适当的离子交换剂可将它们提纯。如TEAE-纤维素*对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。三乙氨基乙基纤维素第30页/共51页7.氨基酸类药物的分离纯化方法氨基酸的生产方法：蛋白质水解法发酵法化学合成与酶促合成法第31页/共51页蛋白质水解法：水解法有酸水解、碱水解和酶水解三种。用盐酸水解为常用方法，其优点是水解迅速、完全，产物全部是L-型氨基酸，缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部分被破坏。碱水解法易产生消旋作用，较少应用。酶水解法水解不够完全。第32页/共51页发酵法：发酵法主要是选育特异产生某种氨基酸的菌株，经过发酵后，从培养液中提纯氨基酸。第33页/共51页化学合成与酶促合成法：化学合成法一般得到的是D/L-型氨基酸，需要对这些异构体拆分；酶促合成法也是酶工程在医药工业上应用的一个内容，优点是技术工艺简单，转化率高，副产物少和易提纯等。第34页/共51页

氨基酸的分离方法：沉淀法吸附法离子交换法

第35页/共51页沉淀法：根据形成沉淀的原理不同分为两种：一种是依据不同氨基酸在水中或其他溶剂中的溶解度差异进行沉淀分离。另一是用特殊试剂沉淀某种氨基酸，如用邻二甲苯-4-磺酸与亮氨酸形成不溶性盐沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸游离出来。第36页/共51页吸附法：这是利用吸附剂根据氨基酸吸附力的差异进行氨基酸分离的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分离就是利用活性炭对其吸附的原理。第37页/共51页离子交换法：氨基酸是两性电解质，在一定pH条件下，不同氨基酸带电性质及解离状态是不相同的，因此在离子交换剂上被吸附的强度不同。常用的离子交换剂为强酸型阳离子交换树脂，洗脱主要用pH梯度洗脱。第38页/共51页高效分离纯化系统的采用

主要是蛋白质分离第39页/共51页（1）固相化金属亲和层析(IMAC)

IMAC是近十年来发展起来的一种亲和层析技术。其原理是利用蛋白质分子中的咪唑基和巯基与一些金属元素(Cu2+、Zn2+等)配位结合，使蛋白质得到分离纯化。该法比传统的凝胶过滤一离子交换法简单、省时，适于实验室规模纯化。第40页/共51页（2）超扩散层析

这种层析所用介质是Biosepra公司生产的Hyper-D。该层析介质的颗粒由刚性框架结构中填充官能化的软凝胶组成。它兼备了软凝胶的高上样量和普通刚性介质的高流速。第41页/共51页这种结构可使层析操作在高流速下进行而保证高上样量和高分辨率，并且无反压产生。Hyper-D具有化学隋性。可用酸碱进行再生和杀菌，可用于纯化免疫球蛋白、白蛋白、激素、酶、细胞培养或发酵产生的蛋白质。适用于实验室小试直至工业化大生产。第42页/共51页(3)灌注层析

1987年由Regnier等人发明的灌注填料技术使快速分离纯化生物大分子得以实现。1989年与之相配套的灌注系统(BioCADworkstation)问世，给微生物制药领域的科学家提供了强有力的工具，给生物制药业带来了突破性的进展。第43页/共51页它所采用的POROUS介质以苯乙烯基二乙烯基苯的聚合物构成，为双模式孔结构，在介质上有80～150nm的扩散孔和600～800nm的贯穿孔。它允许液体对流到分离介质的内表面，从而大大加快了分离速度。灌注层析系统可有效、快速地纯化各种蛋白质、多肽、核酸等生物大分子。第44页/共51页它比传统柱快l0～100倍，分析一个样品只需要0.5～3min。日本制药公司Otsuka使用博大生物技术公司的POROS-50介质和大生产规模系统(autopilot)生产单克隆抗体，从320L样品中纯化出13g抗体只花了80min，收率95％。第45页/共51页(4)其他快速分离纯化系统①streamline扩张柱床吸附技术：已广泛应用于E．coli如包涵体、胞内、细胞膜、胞外分泌和酵母、动物、杂交瘤细胞、昆虫细胞等表达的重组蛋白的纯化，也被用于单抗及天然酶的纯化。第46页/共51页②AKTAexplorer快速纯化开拓系统：能高效地纯化各种蛋白质、肽、寡核苷酸和核酸等。系统有预编程序，放好样品，按启动按钮，系统就会完成余下的工作，如自动取样、制备适当pH缓冲液、选择适当的柱、再现显示分离流程和检测状况、收集峰、自动进行数据处理并打印纯化报告。设置的预