细菌与酵母表面展示技术课件

细菌表面展示技术

酵母表面展示技术

第七组定义：细菌表面展示技术是利用基因工程手段将某一蛋白或短肽段（靶蛋白）与微生物外膜蛋白（载体蛋白）以融合蛋白的形式呈现在细胞表面。外源蛋白与载体蛋白结合方式C端融合(N端锚定在外膜)N端融合

(C端锚定在外膜)夹心融合(有些蛋白本身具有信号肽序列及锚定于外膜的序列，内部合适位点插入外源蛋白)早期研究多集中在革兰氏阴性菌。原因是遗传背景清楚，便于控制蛋白展示。但是从应用上来看，革兰氏阳性菌的某些特性更适合于表面展示。如下表：缺点：转化率低，限制构建较大容量的肽库；一些革兰氏阳性菌分泌大量蛋白酶，这会给应用带来麻烦。细菌表面展示技术，结合荧光激活细胞筛选仪或流式细胞筛选仪，是非常有效的高通量筛选方法。优点：1、能够决定突变体库中每个克隆的功能特性。2、目前唯一能够定量检验单细胞水平和大量突变体催化活性的方法。3、定量分析酶活性4、同时检测多个参数并且对每个观察到的克隆进行记录。与噬菌体相比：细菌表面展示技术在疫苗应用上具有独特优势；进行更快速更高效筛选与传统的生物陶选技术相比，荧光激活细胞筛选仪具有以下特色

①高富集比

②高阳性率

③避免“亲和效应”综上所述，细菌表面展示系统灵活多样，操作简便，在多个领域显示出广泛的应用前景，随着新的载体系统的发展和其自身的不断完善，细菌表面展示技术必将在实践中发挥更大的作用。酵母表面展示技术

简介：

酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术创立以后发展起来的展示系统。酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物的细胞非常相似，对人的蛋白质表达和展示具有优越性。酵母细胞颗粒大，可用流式细胞仪进行筛选和分离。目前报道的两种酵母展示系统分别以α-凝集素作为融合骨架。1.目的蛋白-α-凝集素表面展示系统此系统将目的蛋白作为N端，与α-凝集素C端部分融合，目的蛋白经α-凝集素展示酵母细胞表面。α-凝集素共价连接到细胞壁的葡聚糖上，其锚定部位由蛋白质C端320个氨基酸组成，富含Ser/Thr残基。Ser/Thr富集区因广泛存在的O-糖基化而拥有的一个杆状构象，可作为空间支持无发挥作用。迄今，已有多个应用α-凝集素的C端作为融合蛋白的报道。第一个通过此系统表达的异源蛋白是α-半乳糖苷酶。Schreuder等将来自瓜儿豆胶的α-半乳糖苷酶的基因插入到酿酒酵母转化酶分泌信号和α-凝集素C端部分编码序列之间。α-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶-α-凝集素（α-Gal-ACI）融合蛋白，均由固有的磷酸果糖激酶(PGK)启动子控制，并且是多拷贝的。批量培养过程中检测了细胞和生长介质中的酶活性，α-半乳糖苷酶被高效分泌入培养介质，而αGal-ACI融合蛋白主要与细胞有关。天然α-凝集素结合活性部位在Aga2p的C端，因此，此处代表了一个细胞外大分子的可及性区域和展示固定蛋白质的有用位点。

酵母有两种交配类型MATa和MATa的单倍体细胞，这两种细胞之间的相互交配融合是通过细胞表达α-凝集素和α-凝集素的相互作用介导的。目前，酵母表面展示技术被广泛应用于蛋白质分子的相互识别、定向进化以及新型疫苗的研制等发面。①蛋白质的定向进化：酵母表面展示系统用于蛋白质亲和力和稳定性的定型进化已有成功报道，最先被用于抗体的亲和力成熟;②活的口服疫苗：在细胞表面表达的蛋白质易于接近抗体，因此，可被免疫系统识别，即使很小的肽，当展示在细胞表面时，也具有免疫原型。因而可通过在酵母表面表达异质性的抗原蛋白来发展疫苗。酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进行筛选和分离，这就使得基于特异定量亲和力改变的的突变体分离成为可能。由于酵母展示的蛋白质是紧密锚定在细胞壁上，可以耐受SDS等的抽取，同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具有很好的应用前景。

前景：

表面展示技术日新月异，酵母展示系统在不断的完善和改进