实验一-DNA提取课件

植物DNA的提取与纯化

DNAextraction实验一实验原理植物DNA的分离是分子生物学、遗传学和育种学等植物科学研究的基础要求。对DNA提取一般有三个要求：1.DNA的纯度可以满足下游操作的要求2.DNA必须完整3.DNA应当有足够的量一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。如果对植物进行大规模筛选，操作程序应当快捷，简便，价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂。核酸的理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。

DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。

天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白质和糖去除，同时除去RNA及无机离子等，从中分离DNA。

提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法，对它们进行稍加修改就可以应用于DNA的微量提取。两种方法均采用去污剂裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解。具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；②化学试剂法：用SDS处理细胞；③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。细胞破碎

SDS法SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。CTAB法CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。DNA提取蛋白质常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。RNA常选用RNase消化，或是用LiCl来消除大分子的RNA。酚类物质提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。多糖提取液中加1％PVP。DNA纯化（去杂质）PVP（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的离子化。2-巯基乙醇作为还原剂可以防止酚类的氧化。适用于提取新鲜植物以及干品、冷冻品的基因组DNA。实验步骤：取新鲜叶片约3g,剪碎,加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中；2.

在65℃预热的提取液中按3.8g/L加入NaBisufite,混匀并调pH至8.0；3.

在管中加入适量提取液，60℃水浴保温约30min，不时颠倒混匀；

4.

冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇，用力摇匀后，放置摇床上摇动15min左右；5.

室温下10000rpm离心15min，小心吸上清于新的离心管中，加入两倍体积的冷酒精，-20℃放置1h或过夜；6.

挑出DNA置于新的管中，挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加入适量70%酒精，摇动洗涤10min，重复洗涤2-3次；

7.

吹干DNA，加入适量TE在65℃溶解，完全溶解后离心去除杂质；

加入RNase（10mg/mL）,室温处理0.5-1h,

除去RNA，4℃或-20℃贮存。

如需纯化DNA，再加入适量TE，氯仿/异戊醇多次抽提后吸取上清，加入3ml/LNaAc和两倍体积的乙醇，-20℃放置1h或过夜；吹干沉淀后，加入适量TE，65℃溶解，4℃或-20℃贮存。

1.植物叶子约3g,剪碎置预冷研钵中

加入液氮充分研磨，注意不能干磨3.60℃水浴保温30-60min6.再次10000rpm离心5min；

将上清小心吸入新的离心管中；

DNA样品在0.9%Agarose胶上电泳（例图）

实验注意事项微量移液枪的使用一定要规范