高等学校省级优秀青年人才基金重点项目申请书1

PAGEPAGE5项目编号：_______高等学校省级优秀青年人才基金重点项申请书项目负责人：刘志刚项目名称：鸭坦布苏病毒病与病毒性肠炎二价基因工程疫苗的研制所在单位：安庆师范学院填表日期：2013-08-08安徽省教育厅2013年制申请者的承诺：我承诺对本人填写的各项内容的真实性负责，保证没有知识产权争议，如获准立项，我承诺以本表为约束性协议，遵守项目管理有关规定，按计划开展研究工作，取得预期成果。项目负责人签字：年月日填表说明一、申请书各项内容必须实事求是，逐项认真填写，表达要明确、严谨，字迹要清楚易辨。二、学科名称必须按照“国家标准GB/T13745-92《学科分类与代码》的二级学科名称填写，封面编号由省教育厅填写。三、项目名称要确切反映申请项目的内容，字数最多不超过24个汉字。四、申请书须A4双面打印一式十份。五、申请书除“简表”外，各栏填写不下时，请自行加页。六、如不能按规定填写，以形式审查不合格处理。二、申请者学习、进修与工作简历类别起迄时间毕业学校毕业论文题目导师学历（本科及以上）2006-2008青岛农业大学影响潍坊地区雏鸡死亡率因素的调查王建琳2009-2012华中农业大学禽流感H5亚型细胞灭活苗研究金梅林进修起迄时间进修单位进修内容成绩2012年10月-至今华中农业大学禽病疫苗及诊断试剂的研制项目负责人近3年承担的教学科研工作及取得的标志性成果刘志刚，男，硕士学历，1984年4月出生，汉族，安庆师范学院动物检疫专业教师，华中农业大学农业部微生物学国家重点实验室客座人员，主要从事动物重大和新发传染病及人畜共患传染病病原基因组学与蛋白质组学、分子致病机理、新型疫苗与分子诊断试剂等方面的研究。主持安庆师范学院青年基金一项；参与863、973、国家科技攻关、国家自然科学基金、国家支撑计划、公益性行业专项等20余项科研课题。在国内外期刊发表论文数篇。刘志刚，刘立峰，陈伦勇，金梅林等。禽流感新型疫苗研究进展，动物医学进展，2013,34（2）99-103刘志刚，吴彦，孙青松。粪便中华支睾吸虫虫卵DNA的提取及PCR检测方法的优化，动物医学进展，2013,34（4）87-89刘志刚，孙青松，金梅林等。鸭坦布苏病毒研究进展,中国动物传染病学报，2013,21(1):81-86刘志刚，吴彦，孙青松。肉鸡黄肝病诊疗报告，黑龙江畜牧兽医，2013,5（2）94-94刘志刚，姚蓉，金梅林等。鸭坦布苏病毒最新研究进展,第五届(2013)中国水禽发展大会会议论文集晁行周，刘志刚，邹忠，金梅林。鸭坦布苏病毒XN株的分离鉴定及遗传进化分析，第五届(2013)中国水禽发展大会会议论文集胡勇，邹忠，刘志刚，金梅林。鸭肠炎病毒研究进展，第五届(2013)中国水禽发展大会会议论文集刘志刚，赵苏红，金梅林等。禽流感H5N2亚型西藏株的分离鉴定与特性分析，中国兽医学报（已接收）DaopingYu,QingfongZhu,ZhigangLiu,ShuyongZhang,andKaiZhao.ACaseofYangtzeFinlessporpoisediedoflobarpneumoniainfield.JournalofWildlifeDiseases(summitted)三、项目立论依据本项目研究目的、意义以及国内外同类研究工作现状（附主要参考文献目录及出处）鸭病毒性肠炎又名鸭瘟，是由鸭肠炎病毒引起的鸭、鹅等雁形目禽类的一种急性、接触性传染病，各年龄的禽类均可发病。鸭病毒性肠炎在很多国家都有该病的报道[1]，在我国也广泛流行。由于其传播迅速，并且发病和死亡率高，能达50-100%，成鸭甚至在90%以上，已经成为危害养鸭业的主要疫病之一。当前，主要采取免疫的方式预防此病。从世界各地分离的毒株，具有共同的免疫原性，能产生交叉免疫，为疫苗的研制带来便利[2]。由于弱毒苗具有快速产生保护力的特点，疫情初始阶段接种疫苗对控制病情也有显著作用，应用的鸭肠炎疫苗基本上是弱毒疫苗[3]。国内主要有以下几种：天然弱毒苗；鸭肠炎鸡胚弱化毒细胞苗；鸭肠炎鸡胚弱毒苗（C-KCE）。此外，程安春等[4]研制了鸭肠炎和鸭肝炎二联弱毒苗。最近陈化兰等[5]将鸭肠炎病毒基因组克隆Cosmid载体上，研制了鸭肠炎和禽流感二价基因工程疫苗。鸭的坦布苏病是由鸭的黄病毒引起鸭的一种传染病，其特征是发热，减食，产蛋减少，腹泻和传染性卵巢炎。2010年春季开始，在中国东部地区的福建、山东和浙江省等省养鸭场集中的狭长地带蛋鸭的产蛋量骤然减少，一些鸭群的产蛋量成直线下降超过了90%[6]。病鸭笨拙地蹒跚而行，共济失调性，采食减少。一些病鸭会在数日内死亡。通过对被感染的动物进行病原的分离鉴定，中国科学院分离出了一种具有侵略性的新型黄病毒（BYD病毒）[7]，其包括黄热病和登革热在内的一类病毒，成为在鸭体内鉴别出的第一种黄病毒。这种病毒对中国养鸭业造成巨大损失，还可能给人类的生命健康造成威胁。该病具有以下几大特点：①流行区域广，造成损失巨大。②传播速度快。③病程急，发病率高，但死亡率较低。东南亚是鸭的消费大国，尤其是中国。由于鸭的坦布苏病毒和感染人的黄病毒的序列的同源性很高，目前为止我们还不能准确的评估鸭的坦布苏病毒的公共卫生意义。人类和鸭子或鸭产品间的密切接触是不可避免的。值得一提的是，还没有有效地疫苗可以用来控制这种疾病。所以，这更给我们带来了机遇与挑战。以上两种鸭病毒性疾病都严重威胁鸭养殖业，一旦爆发禽流感或鸭黄病毒疫情，将会造成巨大的经济损失和严重的公共卫生安全隐患。而目前针对鸭的这三种病毒性疾病没有特异性的治疗药物，仅仅禽流感有部分亚型有油佐剂疫苗，鸭瘟有鸡胚传代弱化活疫苗[8]，值得一提的是，黄病毒还没有有效地疫苗可以用来控制这种疾病。在鸭养殖过程中，有一个不可忽视的情况就是，鸭比较胆小，容易受惊吓，对外界环境敏感，多次免疫会给鸭带来很严重的应激反应，严重影响鸭的生长、免疫力下降，导致料肉比增高，造成经济损失。鸭肠炎病毒作为载体的优势：①鸭瘟病毒属于α-疱疹病毒，作为一种DNA病毒,基因组长达158KB,具有很多的基因间隙和一些复制非必须基因，有很强的容纳外源基因的能力[9]。②鸭瘟病毒的宿主窄，鸭是其自然宿主，所以用做载体疫苗对于人和其他家畜很安全。③鸭瘟病毒能潜伏在三叉神经节、淋巴样组织和外周血淋巴细胞持续的诱导机体产生细胞免疫和体液免疫[10]。鉴于以上优点，构建了鸭肠炎病毒的细菌人工染色体，利用MAGIC的方法在细菌内快速，稳定的重组和鸭坦布苏病毒的E基因。研发一种安全有效地鸭肠炎病毒-坦布苏病毒的二联疫苗，从而保护鸭子免受这些病毒的侵害，最终达到一针防二病的效果。一针防多病的预防措施是广大鸭养殖户的理想养殖方式，这样既可以较少人力物力，减少对鸭子的多次刺激带来的应激反应，更重要的是能够减少经济支出，提高经济效益，安全养鸭，科学养鸭。1.GoughRE.Laboratoryconfirmedoutbreaksofduckvirusenteritis(duckplague)intheUnitedKingdomfrom1977to1982.VetRec,1984,114(11):262-5.2.XuJ,

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2013May,98(2):344-51.4.程安春,汪铭书,刘菲等.PCR在鸭瘟临床诊断和免疫及致病机理研究中的初步应用.病毒学报,2004,20(4):364-370.5.LiuJ,ChenP,JiangY,WuL,ZengX,TianG,GeJ,KawaokaY,BuZ,ChenH.Aduckenteritisvirus-vectoredbivalentlivevaccineprovidesfastandcompleteprotectionagainstH5N1avianinfluenzavirusinfectioninducks.JVirol,2011Nov;85(21):10989-98.6.HoshinoK,IsawaH,TsudaY,etal.GeneticcharacterizationofanewinsectflavivirusisolatedfromCulexpipiensmosquitoinJapan[J].Virology,2007,359(2):405-414.7.TangY,DiaoY,GaoX,etal.AnalysisofthecompletegenomeofTembusuvirus,aflavivirusisolatedfromducksinChina[J].TransboundEmergDis,2012,59(4):336-343.8．HuY,

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duck

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2013Jan;171(1):238-41.四、项目研究内容、工作方案1、研究目标、研究内容以及拟解决的关键问题（1）构建含有重组同源臂的BAC载体：将BAC载体插入弱毒株C-KCE基因组，构建含有重组同源臂的BAC载体。（已完成）（2）将BAC载体插入DEV基因组：提取DEV基因组与（1）构建的BAC载体共转染鸡胚成纤维细胞，使二者发生同源重组，然后挑取含有BAC载体的病毒，鉴定其稳定性。（已完成）（3）建立DEV的感染性克隆DEV-BAC：从鸭胚成纤维细胞提取（2）构建的含有BAC载体的病毒的基因组，电转入大肠杆菌DH10B-IS中，使其稳定复制；再从DH10B-IS中提取BAC化的病毒基因组转染鸡胚成纤维细胞，能产生感染性病毒粒子则表明建立了稳定的DEV感染性克隆。（已完成）（4）运用MAGIC在细菌中将坦布苏的E基因重组到C-KCE上建立修饰病毒基因组的方法：通过细菌的接合转移，在I-Sce1催化和Red-gam重组酶介导下供体质粒和受体质粒在特定位点同源重组，获得重组病毒。具体如下，将已诱变的目的基因克隆到pRT1质粒上，将含供体质粒pRT1的供体菌DH10β在Amp（100μg/ml）的LB培养基中培养；受体菌DH10B（已转化DEV-BAC和pML300）在含有壮观霉素（50μg/ml）、氯霉素（Cam,30μg/ml）和0.2%葡萄糖的LB培养基中30℃培养（避免重组酶表达），24小时后将受体菌用LB洗两次，在添加0.2%鼠李糖（诱导Red-gam重组酶表达）的LB培养基中30℃培养。供体菌和受体菌按比例混合，37℃静置在含0.2%阿拉伯糖（0.2%Ara,诱导I-Sce1表达）的LB中培养4小时使二者接合。然后涂布Cam的固体LB培养基，42℃培养过夜。第二天随机挑取单菌落，用PCR和测序鉴定重组克隆。基本路线如下图。最后，用CRE-LoxP系统删除BAC骨架，构建仅含有突变基因的重组病毒。（5）建立形成不含BAC载体的DEV-E病毒的方法：将BAC-DEV-E的感染性克隆和能表达Cre位点特异性重组酶的质粒pCre共转染鸡胚胚成纤维细胞。BAC载体两端具有同向的loxP位点，这两个位点在Cre的作用下发生位点特异性重组方式，删除BAC骨架，形成不含BAC载体的更接近天然病毒的DEV-E病毒粒子。如下图所示：（6）westernblot检测E蛋白的表达，以及DEV和DEV-E在鸡胚成纤维细胞内生长曲线的绘制。（7）动物实验：DEV-E病毒分别对鸭肠炎病毒，坦布苏病毒的免疫保护率的测定以商用的疫苗作为对照评价其效果。2、拟采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、研究路线、研究手段与关键技术）关键技术说明基于BAC克隆的基因打靶同源重组和位点特异性重组是广泛被用于修饰BAC克隆的方法。RecA同源重组系统是最早为人们熟知的大肠杆菌同源重组系统。然而，由RecA介导的同源重组所需同源区长达1000bp左右，操作的难度大，相对耗时费力，从而使其应用受到很大程度的限制。RecE/RecT同源重组系统可以催化同源反应在20-25bp的同源区间发生，同源重组效率较高（MuyrersJPetal.,2000;WagnerMetal.,2002;MuyrersJPetal.,2000a）。Red-gam系统与RecE/RecT类似，且重组效率更高（MuyrersJPetal.,2000b;JamsaiDetal.,2003）。至此，人们把这两种重组技术结合起来（Red/ET）实现了直接以PCR产物作为供体分子对目的序列的打靶修饰，可以有效地对BAC克隆上的任意基因进行点突变、插入和缺失等修饰。位点特异性重组是由位点特异性重组酶介导特定位点间的发生位点特异性重组。通用的系统有P1噬菌体的Cre-loxP系统（SmithGAetal.,2000），入噬菌体的Int-att系统（SuzukiYetal.,2005），和酵母的Flp-FRT系统（CherepanovPPetal.,1995）。位点特异性重组技术靶向性强、重组效率高，也是修饰BAC克隆的有效工具。这整个过程都是在细菌体内进行的，在很大程度上能避免了离体操作对大分子的损伤。2005年，LiMZetal.开发了一个有效的方法，用于同源重组方法在体内构建重组DNA分子——交配辅助遗传整合克隆(MAGIC)（LiMZetal.,2005）。可行性分析（1）理论上，BAC载体可以克隆大至300kb的片段，而且可以在大肠杆菌中稳定的复制。近年来，很多疱疹病毒的基因组都被BAC化；Red-gam、Cre-loxP等重组系统也被广泛用于修饰病毒基因，构建各种重组病毒；因此，将BAC化技术和各种重组技术用于研究鸭肠炎病毒的毒力基因的功能具有可行性。（2）研究条件上，本课题组已经有开展本研究所需的病毒株、质粒和细胞系；本实验室长期从事用常规方法构建重组伪狂犬病毒，因此，在构建重组病毒操作的所有环节都上没有障碍。（3）申请者在硕士期间从事过鸭肠炎病毒基因组结构和基因功能的研究，积累了培养病毒和提取基因组的经验，具备研究本课题所需的相关条件；本人一直从事分子生物学方面的研究，熟练大部分分子操作，例如基因克隆、基因突变、细胞培养以及病毒分离培养等技术。3、本项目特色与创新点（1）研究内容创新：鸭肠炎病毒具有高致死力，但是对于鸭肠炎病毒这样的大基因组病毒（150kb），本研究开发的DEV-BAC克隆和快速同源重组技术，是研究鸭肠炎病毒基因功能的强大工具。此外，该感染性克隆也是很有应用前景的病毒载体，可用于表达外源抗原或有潜在治疗作用的基因，用于多价疫苗的生产和基因治疗等方面的研究。（2）研究思路和方法创新：本研究提出了一种新的、基于细菌接合和大肠杆菌体内同源重组的DEV-BAC构建技术。除了供体载体的构建外，其它重组过程都在大肠杆菌进行。通过细菌的接合介导克隆了目的片段的供体质粒从供体菌转移到受体菌中，由受体菌表达的I-Sce1在靶位点切割供体和受体质粒，然后由Red-gam重组酶介导供体质粒和受体质粒在特定位点同源重组，获得重组病毒（周期大约是2周）。该方法有以下特点：①使用小的供体转移载体克隆基因，在此载体上可以对目的基因进行多种修饰，而不需要每次诱变都要从头开始，减少了操作步骤。②在这个系统中，供体质粒使用的是条件复制子，它在受体菌种后，不能复制，这就保证消除野生病毒的污染，高效的获得重组病毒。③克隆效率高，本系统对受体菌株进行了遗传修饰，将稀有内切酶I-Sce1的表达盒式插入染色体的基因组上，在Ara的诱导下，I-Sce1得到表达，进一步降低野生病毒的污染，提高重组效率。4、项目年度研究计划进度安排总目标：研制出鸭坦布苏病毒病与病毒性肠炎二价基因工程疫苗，并申报新兽药证书。2013.03-2013.05课题计划：筛选鸭坦布苏病毒病与病毒性肠炎二价基因工程疫苗毒株；构建含有重组同源臂的BAC载体；将BAC载体插入DEV基因组。2013.06-2013.12课题计划：建立DEV的感染性克隆DEV-BAC；运用MAGIC在细菌中将坦布苏的E基因重组到C-KCE上建立修饰病毒基因组的方法；建立形成不含BAC载体的DEV-E病毒的方法。2014.01-2015.01课题计划：westernblot检测E蛋白的表达，以及DEV和DEV-E在鸡胚成纤维细胞内生长曲线的绘制；动物实验：DEVE病毒分别对鸭肠炎病毒，坦布苏病毒的免疫保护率的测定，以商用的疫苗作为对照评价其效果。2015.02-2016.02课题计划：疫苗临床实验；相关标准的制定及撰写；申报新兽药证书。5、预期研究成果形式、去向与效益分析（1）申报新兽药证书一项