酶工程第十节酶与现代生命科学

酶工程第十节酶与现代生命科学第1页，共48页，2023年，2月20日，星期二

一、酶是分子生物学研究的重要工具

酶是分子生物学研究的重要工具。特别是限制性核酸内切酶的发现提供了特异剪切DNA的工具,促进了DNA重组技术诞生,推动了基因工程发展,成为分子生物学研究的不可缺少的工具.

HindⅡ的识别序列和切割位点

↓

5’---GTPyPUAC–-3’

3’---CAPUPyTG–-5’

↑

第2页，共48页，2023年，2月20日，星期二

限制性内切酶在基因工程中的应用

基因工程（geneticengineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是根据人们预先设想，采用酶学的方法，将目的基因（所需要的基因）重组到一个适宜的载体上组成重组子，再将重组子转化到适当受体细胞中进行扩增表达，以达到改造生物细胞的目的的技术。基因工程的整个过程由工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部分组成。前者主要在实验室里进行，其单元操作过程如下：第3页，共48页，2023年，2月20日，星期二第4页，共48页，2023年，2月20日，星期二

基因工程的单元操作过程如下：（1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开。（2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子。（3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。（4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整含到受体细胞的基因组中。（5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。

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关于限制性内切酶

Restrictionendonueleases

限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶。主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到1000种以上，搞清识别序列的有300种以上。第6页，共48页，2023年，2月20日，星期二

有关限制性内切酶发现的几个重要实验

50年代初，Luria和Human在研究T4噬菌体感染作用、Bertani和Weigle在研究和P2噬菌体与宿主细胞关系时，发现了细菌内限制与修饰现象。发现了细菌内存在限制修饰系统，在这两个系统中包括限制酶和修饰酶。限制酶能识别并降解与自身无关的外源DNA，而修饰酶则可通过甲基化修饰自身DNA，免被限制酶降解。

第7页，共48页，2023年，2月20日，星期二Bertani和Weigle大肠杆菌噬菌体感染实验

Bertani和Weigle在探索和P2噬菌体与宿主细胞关系时，均提出了噬菌体感染大肠杆菌后，宿主细胞对入侵的噬菌体DNA表现有特异的限制作用。•CEcoli.CEcoli.CEcoli.K12大量繁殖受到抑制第8页，共48页，2023年，2月20日，星期二Meselson和Yuan实验

噬菌体

•K12和

•C的DNA分别与由K12菌体制备的细胞抽提物保温，并藉蔗糖密度梯度离心观察两种DNA沉降速度的变化。•K12DNA•CDNA加入K12菌体制备的细胞抽提物蔗糖密度梯度离心第9页，共48页，2023年，2月20日，星期二

实验表明，这种限制的本质是宿主细胞K12中存在有能使外来DNA(•CDNA)有限降解的核酸水解酶。

此后，又进一步证实了大肠杆菌K12中的修饰体系即为甲基化酶，该酶修饰了

•K12DNA上的特异部位，使其不被限制体系的酶切割。结论表明：第10页，共48页，2023年，2月20日，星期二1965年阿尔伯首次从理论上提出了生物体内存在着一种具有切割基因功能的限制性内切酶。并于1968年成功分离出I型限制性内切酶与修饰酶。证实在细菌内存在两种不同功能但又相关的酶。1970年史密斯从流感噬血杆菌d株中分离出了II型限制性内切酶；同年内森斯使用该酶降解猕猴肿瘤病毒SV40的DNA，首次完成了对基因的切割，排列了酶切图谱。从此成为分子克隆技术中不可缺少的工具酶，推动了基因工程的发展。1978年，上述三人因对限制性内切酶的贡献获得诺贝尔奖。第11页，共48页，2023年，2月20日，星期二阿尔伯(1929～)瑞士微生物遗传学家

H.O.史密斯(1931～)美国分子生物学家、遗传学家

内森斯(1928～)美国微生物遗传学家

第12页，共48页，2023年，2月20日，星期二

限制性内切酶命名规则

限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，即由其属名的第一个字母(大写)与种名的第一、二两个字母(小写)组成酶的基本命名，若酶的产生菌有株系之分，则有4个或4个以上拉丁字母组成，其第四个字母之后表示株系。如EcoRI来源于Echerichia.coli

RY13BamHI来源于B.amyloliquefaciens第13页，共48页，2023年，2月20日，星期二HindIIHaemophilus(属名)Influenzae(种名)d(株系)罗马数字限制性内切酶命名举例第14页，共48页，2023年，2月20日，星期二

限制性内切酶分类已发现的限制酶可以分为三类或称作三型：I、II、III型。他们在酶反应中所需要的辅因子和切割DNA的位点都不相同，而且酶蛋白分子的大小和组成上也有差别。第15页，共48页，2023年，2月20日，星期二

类别反应必须因子专一性

活性I型S-腺苷基蛋氨酸，ATP，Mg2+识别部位和切点不同，无特定切割位点内切甲基化II型Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位只有限制酶活性III型ATP，Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位内切甲基化限制性内切酶分类第16页，共48页，2023年，2月20日，星期二第17页，共48页，2023年，2月20日，星期二

二、

II型限制性内切酶的特性

II型限制酶的识别特异性

回文识别序列

II型限制酶的识别序列大多是具有双重对称结构性结构,或称回文序列

(PalindromicSequence)第18页，共48页，2023年，2月20日，星期二

非典型回文识别序列

回文识别序列被一至几个其他核苷酸（N）所间隔，得到的是非典型的双轴对称性序列。

BglI

GCCNNNNNGGCMstII

CCTNAGG第19页，共48页，2023年，2月20日，星期二

非回文识别序列

也有些限制酶识别序列非回文结构，切割位点在距识别序列5至13个bp处。5’GACGCNNNNN

3’3’CTGCGNNNNNNNNNN

5’例：HgnI

GACGC第20页，共48页，2023年，2月20日，星期二

有些限制酶可识别多重序列。如：HindII，识别序列为GTPyPuAC，可识别三种序列。GTPyPuACGTCAACGTCGACGTTAACGTTGAC嘌呤（Purine）嘧啶（Pyrimidine）类似的内切酶还有AccI、AvaI、BanI、HaeI等，它们的特异性低于单一识别序列的酶。第21页，共48页，2023年，2月20日，星期二

识别序列的长度与剪切频率

大部分II型限制性内切酶的识别序列长度为4-8个核苷酸。识别长度决定了剪切DNA的频率（1/4n，n为识别的长度）。识别长度愈长，则切点少、产生片段少而长度长，酶特异性高。第22页，共48页，2023年，2月20日，星期二限制酶的切割特异性和酶切片段的末端结构

切割位点专一作为工具酶的限制性内切酶有固定的切割位点；产物具有特定的末端结构当一个DNA分子被限制酶切开后形成两个末端，全部产物具有相同的末端结构。即一种限制性内切酶切割任何DNA只产生一种固定形式的末端结构，在DNA连接酶的作用下，磷酸二酯键可以修复而成为一个重组的DNA分子；而不同限制酶则形成不同末端结构。5’-G3’-CTTAA

+AATTC-3’G-5’5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

DNA连接酶5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’第23页，共48页，2023年，2月20日，星期二

任何一种限制酶切割DNA链时，总是水解核苷酸

3’、5’-磷酸双酯键的3’位磷酸酯键，使产物的5’端带磷酸单酯基团，而3’为游离羟基。由于切割位点不同，所有的限制酶可产生两类末端结构

①平末端（BluntEnd）指酶切片段为齐头末端结构。②粘性末端（CohesiveEnd）酶切后DNA片段末端带有

1-4个核苷酸残基长度的单链结构，而片段两端突出的单链具有互补的序列。粘性末端又可分为5‘-粘性末端与

3’-粘性末端。

5’

NOH3’

5’PO4N3’第24页，共48页，2023年，2月20日，星期二第25页，共48页，2023年，2月20日，星期二粘性末端3’-粘性末端5’-粘性末端平末端5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’EcoRI

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’第26页，共48页，2023年，2月20日，星期二

有没有例外？（1）相同的限制性内切酶不总是产生匹配的片段A）含多重识别序列的限制酶

如

HindII在顺序GTPyPuAC

剪切，可产生3种不同类型片段，互相连接的可能性为1/3。B）含非典型识别序列的限制酶如EcoNI在顺序CCTNNNNNAGC剪切，N可以是任何核苷酸，由于N的随意性，往往会产生不广泛匹配的片段。C）在次理想条件下，限制酶表现出星状活性，影响正常匹配。第27页，共48页，2023年，2月20日，星期二

（2）不同的限制性内切酶有时可以产生匹配的片段

例：BamHIGGATCC BclITGATCA BglIIAGATCT

这类能产生相同粘性末端而识别特异性不同的限制酶称作同尾限制酶（Isocaudarner）。同尾限制酶产生的DNA片段可借DNA连接酶互相重组，但新产生的杂合序列将不再被原有的限制酶所识别。

5’-G

GATCT-3’

DNA

5’-GGATCT-3’

3’-CCTAG

A-5’

连接酶

3’-CCTAGA-5’

(BamHI片段)(BglII片段)(产生杂合识别序列)第28页，共48页，2023年，2月20日，星期二

酶反应条件

按手册或商品说明书反应缓冲液：根据不同酶使用高、中或低盐缓冲液。常用的缓冲液选择Tris-Hcl

。同时还要加入Mgcl2

和2-巯基乙醇。反应温度：一般限制性内切酶的反应温度是37○c。酶活性单位：1个酶活性单位是指一种酶在其最适宜的反应条件下，1小时使1μgλ噬菌体DNA

底物完全水解的酶量。但由于许多因素可影响内切酶的水解反应和用量，实际用量需比所需用量多加一倍左右。第29页，共48页，2023年，2月20日，星期二

第二活性

在次理想条件下,一些限制性内切酶的特异型会被降低,只有部分正常识别位置被识别,此称为第二活性（SecondaryActivity），也称星号活性（StarActivity），加以“*”表示，如EcoRI*。酶的第二活性将引起底物DNA链上切口增多，酶解片断变小，造成特异性降低。例：理想条件下（PH=7.5）EcoRIGAATTC

次理想条件下（PH=8.5）EcoRI*AATT次理想条件：通常包括不适合的离子强度、过高的PH、二价金属离子的替换、较高的甘油浓度等。第30页，共48页，2023年，2月20日，星期二

限制酶的保质期

一般是在检定日以后的一年内，但几乎所有的限制酶在超过保质期后都不会急剧失活,因此购入后即使是经过长时间保存的酶,也完全可以使用，但这些酶在使用前最好再测一次活性。另外，保存酶时即便让其冻结，大部分酶也不会急剧失活。第31页，共48页，2023年，2月20日，星期二EcoRI第32页，共48页，2023年，2月20日，星期二PstI第33页，共48页，2023年，2月20日，星期二SmaI

return第34页，共48页，2023年，2月20日，星期二

研究酶的理化性质及其作用原理，对于阐明生命现象的本质和规律具有十分重要的意义（包括酶的结构功能、酶与代谢调节、酶与生物的生长、发育、进化、疾病等）。

从酶分子水平去探讨酶与生命活动、与代谢调节、与疾病、生长发育等等的关系，对阐明某些生命活动的本质和规律，无疑也具有十分重要的意义。

二、酶是生命科学研究的重要对象第35页，共48页，2023年，2月20日，星期二

同功酶同工酶(isoenzyme)是指催化的化学反应相同，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶,存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。目前已发现有150多种酶具有同工酶，如6-磷酸葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、酸性和碱性磷酸酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶、肌酸磷酸激酶、核糖核酸酶、过氧化酶和胆碱酯酶等。其中，发现最早，研究最多的是乳酸脱氢酶（LDH）同工酶.第36页，共48页，2023年，2月20日，星期二例：LDH同工酶的两种亚基以不同比例组成五种四聚体：LDH1(H4)、LDH2(H3M)、LDH3(H2M2)、LDH4(HM3)和LDH5(M4)。

DogfishLDHM4结构图

第37页，共48页，2023年，2月20日，星期二

同功酶与物种进化

同工酶是生物进化过程中为适应愈趋复杂的代谢而引起的一种分子进化，以适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要.

同功酶在各器官和组织中的分布不同。这样就可以根据同工酶酶谱差异并配合其它方法从分子水平探讨物种进化、遗传变异等一些生命现象。第38页，共48页，2023年，2月20日，星期二

在正常情况下血清中同功酶谱是相对稳定的。当某一组织或器官发生病变时，就有某种特殊的同工酶释放出来，引起血清中同功酶活性的改变。对病人及正常人同工酶电泳图谱进行比较，有助于上述器官疾病的诊断。

在临床上已应用同工酶做诊断指标,例如:

冠心病及冠状动脉血栓引起的心肌受损者血清中LDH(H4)及LDH2(MH3)含量增高;

而肝细胞受损患者血清中LDH5(M4)增高。第39页，共48页，2023年，2月20日，星期二

同功酶与其它

同工酶的研究不仅在临床血液病、肿瘤及其它疾病的诊断方面占有重要地位，而且在分子遗传学、物种鉴定、法庭取证、亲子鉴定、优生优育等领域中也具有广阔的应用前景。

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肿瘤的酶异常

肿瘤酶异常原因：1、肿瘤过多或过少产生酶2、肿瘤阻塞了酶通过的导管系统3、肿瘤诱导酶产生4、细胞通透性改变使可溶性酶进入血液循环

第41页，共48页，2023年，2月20日，星期二

临床诊断还没有单一指标可确诊癌，所以酶测定可作为一种辅助手段，如：测定血清淀粉酶——胰腺癌酸性磷酸酶——前列腺癌亮氨酸氨肽酶、硫酸酯酶、乳酸脱氢酶等同工酶谱变化———肝癌、结肠癌、直肠癌。第42页，共48页，2023年，2月20日，星期二端粒酶

端粒、端粒酶与肿瘤发生的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一。有研究表明,端粒酶在85%～95%的恶性肿瘤组织中有阳性