现代生化技术下

现代生化技术下第1页/共73页现代生化技术2第2页/共73页第二篇生化检测技术第一章生物大分子化学和光学检测技术糖的化学及光学检测技术蛋白化学及光学检测技术核酸化学及光学检测技术第3页/共73页第一节糖的测定第4页/共73页1.1费林试剂热滴定法（兰-爱龙法）在碱性溶液中，还原糖能将Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金属离子还原，而糖本身被氧化成糖酸及其他产物。费林试剂由甲、乙两种溶液组成。甲液含硫酸铜(提供与糖反应的二价铜）和亚甲基蓝（氧化还原指示剂）乙液含氢氧化钠（提供碱性环境）；酒石酸钾钠（氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，生成可溶性的络合物酒石酸钾钠铜，这样铜离子参与的反应能成均相反应）；亚铁氰化钾与氧化亚铜反应生成可溶性复盐，便于观察滴定终点第5页/共73页在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧化亚铜沉淀，其反应如下：滴定时以亚甲基蓝为氧化－还原指示剂。因为亚甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜离子全部被还原后，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。根据样液量可计算出还原糖含量。反应生成的氧化亚铜沉淀可与费林试剂中的亚铁氰化钾（黄血盐）反应生成可溶性复盐，便于观察滴定终点。Cu2O+K4Fe(CN)6+H2OCu2O+K4Fe(CN)6+H2OK2Cu2Fe(CN)6+2KOH第6页/共73页亚甲基蓝（氧化型-蓝）亚甲基蓝（还原型-白）第7页/共73页操作方法一、样品中还原糖的提取准确称取1g藕粉，放在100mL烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加入约40mL蒸馏水，混匀，于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出。过滤，将滤液全部收集在50mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。第8页/共73页二、样品中总糖的水解及提取准确称取1g淀粉，放在大试管中，加入6mol/LHCl10mL，蒸馏水15mL，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6mol/LNaOH溶液中和(反应必须在碱性条件下进行）至溶液呈微红色（pH9)，并定容到100mL，过滤取滤液10mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。第9页/共73页三、空白滴定准确吸取费林试剂甲液和乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL。从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值第10页/共73页四、样品糖的定量测定(1)样品溶液预测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要保持溶液呈沸腾状态。待溶液由蓝色变浅时，以每2s1滴的速度滴定，直至溶液的蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。(2)样品溶液测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL，置于锥形瓶中，加蒸馏水10mL，加玻璃珠3粒，从滴定管中加入比与测试样品溶液消耗的总体积少1mL的样品溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值。第11页/共73页注意事项（1）费林试剂甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。（2）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。（3）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。第12页/共73页

I2+2OH-

IO-+I-+H2OC6H12O6+IO-+OH-

C6H12O7-+I-+H2O3IO-IO3-+2I-IO3-+5I-+6H+

3I2+3H2O酸性条件下葡萄糖酸1.2次碘酸法（醛糖）-碘间接滴定法总碘剩余碘氧化还原糖的碘第13页/共73页1.3铜试剂法

COOKH―C―O

H―C―O

COONa

Cu

CHO

（CHOH）4+2H2O=2

CH2OH

COOK

H―C―OH

H―C―OH

COONaCOOH（CHOH）4+Cu2O↓CH2OH

+

+2葡萄糖酒石酸甲钠菲林试剂I2+2S2O3S4O6+2I¯IO3¯+5I¯+6H3I2+3H2O+Cu2O+I2+HCu+I¯+H2O+2+2-2-I2+2S2O3S4O6+2I¯IO3¯+5I¯+6H3I2+3H2O+Cu2O+I2+HCu+I¯+H2O+2+2-2-I2+2S2O3S4O6+2I¯IO3¯+5I¯+6H3I2+3H2O+Cu2O+I2+HCu+I¯+H2O+2+2-2-I2+2S2O3S4O6+2I¯I2+2S2O3S4O6+2I¯I2+2S2O3S4O6+2I¯IO3¯+5I¯+6H3I2+3H2O+Cu2O+I2+HCu+I¯+H2O+2+2-2-I2+2S2O3S4O6+2I¯I2+2S2O3S4O6+2I¯I2+2S2O3S4O6+2I¯IO3¯+5I¯+6H3I2+3H2O+Cu2O+I2+HCu+I¯+H2O+2+2-2-生成的氧化亚铜用碘滴定剩余的碘再用硫代硫酸钠滴定淀粉做指示剂第14页/共73页1.5血糖的斐林法测定（Folin-Wu法）血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。第15页/共73页操作取具25ml刻度的血糖管3只，编号，用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第一只血糖管中，于第二只血糖管中加2ml标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加2ml蒸馏水。然后各加2ml新配置的碱性硫酸铜溶液，同时置沸水浴内煮6min，取出，在流水中迅速冷却各加入4ml酸性钼酸盐溶液，1min后以蒸馏水稀释至25ml，混匀，倒入比色杯，用722型风光光度计于420～440nm波长比色（先以空白管调节零点，然后测标准管和样品管）第16页/共73页1.63，5-二硝基水杨酸法（DNS）实验原理单糖都是还原糖，均可以利用其还原性进行定量，但是双糖和多糖等则不一定就是还原糖，利用糖的溶解度不同可以把还原糖和非还原糖分离开，然后利用多糖的酸水解，使之转化为有还原性的单糖，从而可以使多糖也可以利用还原性进行定量。3，5－二硝基水杨酸和还原糖共热后，被还原成棕色的化合物，颜色的深浅在一定范围内和还原糖的含量成线性关系，在540nm处进行比色测定，求出还原糖的量，进而求出总糖的含量。第17页/共73页操作(1)样品中还原糖的提取：称取甘薯粉1.0g放入小烧杯中，先加入少量水调成糊状，再加入约50mL水摇匀，煮沸约数分钟，使还原糖浸出，然后转移至100mL容量瓶中定容，经过滤的上清液用于还原糖的测定。(2)样品中总糖的水解和提取：称甘薯粉1.0g放入小烧杯中，先加入6mol/LHCl10mL，水15mL，搅匀后放入沸水浴加热水解30min，冷却后用6mol/LNaOH调pH到中性（1滴酚酞试剂检测呈微红）然后转移至100mL容量瓶中定容，过滤后，取10mL上清液稀释至100mL即为稀释1000倍的总糖水解液。(3)还原糖和总糖的测定：分别吸取上述还原糖溶液和总糖溶液水解液1mL于试管中，以制作标准曲线相同的方法加入DNS试剂1mL，沸水浴加热5min，取出冷却后再加入蒸馏水8mL，摇匀，分光光度计540nm处测定吸光值。第18页/共73页1.7硫酸-苯酚法多糖在浓硫酸作用下，先水解成单糖，单糖继续脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10～100μg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，基本不受蛋白质存在的影响（蛋白变性试剂）第19页/共73页操作步骤

1．标准曲线的制作按顺序向试管内加入1ml9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面快速加入5ml浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8ml，在恒温下放置30min，显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。第20页/共73页2．可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10～0.30g，共3份，或干材料。分别放入3支刻度试管中，加入5～10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。3．测定吸取0.5ml样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5ml，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚，浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。第21页/共73页1.8蒽酮法第22页/共73页操作1．葡萄糖标准曲线的制作取6支20ml具寒试管，编号，配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。

糖含量测定2.样品测定用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度试管中，加1ml水和0.5ml蒽酮试剂。再缓慢加入5ml浓H2SO4（注意：浓硫酸遇水会产生大量的热！），盖上试管塞后，轻轻摇匀，再置沸水浴中10分钟。冷却至室温后，在波长620nm下比色，记录光密度值。查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量（μg）。第23页/共73页1.9邻甲苯胺法测定血糖葡萄糖在热的醋酸溶液中，与邻甲苯胺缩合成雪夫氏碱(Schiffbase)。雪夫氏碱呈兰绿色，其最高吸收峰为620nm波长，颜色深浅与葡萄糖量成正比，和标准液比较求得其量。本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与醛糖显色，血液中其他还原性物质基本上无影响。第24页/共73页第25页/共73页第二节蛋白的检测技术目前常用的有四种古老的经典方法:凯式定氮法，缩脲法(Biuret法),Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法(Bradford法)其中Bradford

法和Lowry法灵敏度高，比紫外吸收法高10-20倍,比Biuret法高100倍以上.凯氏定氮法比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质第26页/共73页

2.1凯氏定氮法原理1.消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。2.加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH,加热后生成NH3,通过蒸馏导出而被吸收。3.滴定：用过量标准HCl吸收NH3，剩余的酸可用标准NaOH滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。此法为回滴法，采用甲基红卫指示剂。本法适用于0.2~2.0mg的氮量测定。第27页/共73页装置1.热源2.烧瓶3.玻璃管4.橡皮管5．玻璃杯6.棒状玻塞7.反应室8.反应室外壳9.夹子10.反应室中插管11.冷凝管12.锥形瓶13.石棉网第28页/共73页实验步骤一、样品处理称取牛血清白蛋白50mg，加入2个凯氏烧瓶中，另2个凯氏烧瓶为空白对照，不加样品。分别在每个凯氏烧瓶中加入约500mg硫酸钾－硫酸铜混合物，再加5mL浓硫酸。二、消化适当加强火力消化,使瓶内液体微微沸腾，大约维持2~3h。待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30％过氧化氢溶液1~2滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色，消化即告完成。冷却后将瓶中的消化液倒入容量瓶中，并以蒸馏水洗涤烧瓶数次，将洗液并入容量瓶中，定容备用。第29页/共73页三、蒸馏1.蒸馏器的洗涤蒸气发生器中盛有加有数滴H2SO4的蒸馏水和数粒沸石。加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受瓶。每次使用前，需用蒸汽洗涤10分钟左右（此时可用一小烧杯承接冷凝水）。将一只盛有5mL2％硼酸液和1~2滴指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏1~2分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。第30页/共73页2.消化样品及蒸馏样品取50mL锥形瓶数个，各加25mL0.01M标准HCl和1~2滴指示剂，放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸没在液体内。取2mL稀释消化液，由小漏斗加入反应室。将一个装有0.01M标准HCl和指示剂的锥形瓶用小量筒量取5mL10MNaOH溶液，倒入小漏斗，让NaOH溶液缓慢流入反应室。尚未完全尽时，加紧夹子，向小漏斗加入约5mL蒸馏水，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封。加热水蒸气发生器，沸腾后使蒸汽冲入蒸馏瓶内，反应生成的NH3逸出被吸收。待氨已蒸馏完全，移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，取下锥形瓶第31页/共73页3.蒸馏后蒸馏器的洗涤蒸馏完毕后，移去热源，夹紧蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温度突然下降，即可将反应室残液吸至收集器。4.滴定以0.01MNaOH标准溶液滴定。记下所耗去的体积。也可是热水浴或者加热夹套第32页/共73页注意事项（1）必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。（2）凯氏定氮仪必须事先反复清洗，保证洁净。（3）小心加样，切勿使样品沾污口部、颈部。（4）消化时，须斜放凯氏烧瓶（45o左右）。火力先小后大，避免黑色消化物溅到瓶口、瓶颈壁上。（5）蒸馏时，小心加入消化液。加样时最好将火力拧小或撤去。蒸馏时，切忌加热装置火力不稳，否则将发生倒吸现象。（6）蒸馏后应及时清洗定氮仪。第33页/共73页2.2双缩脲试剂测定蛋白质含量具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成与Cu2+形成紫红色络合物，其最大光吸收在540nm处。该法测定蛋白质的浓度范围适于1~10mg/mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。紫红色铜双缩脲复合物分子结构双缩脲的结构第34页/共73页操作方法一、制作标准曲线取12支试管分成两组，按下表平行操作：

012345标准蛋白液(mL)00.20.40.60.81.0蛋白浓度(mg/mL)02.04.06.08.010.0蒸馏水(mL)1.00.80.60.40.20.0双缩脲试剂(mL)4.04.04.04.04.04.0充分混匀后，室温下（20—25℃）放置30minA540

第35页/共73页二、样品测定取4支试管分成两组，按下表平行操作：

01血清稀释液(mL)00.5蒸馏水(mL)1.00.5双缩脲试剂(mL)4.04.0充分混匀后，室温下（20—25℃）放置30minA540

第36页/共73页注意事项（1）须于显色后30min内比色测定。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。（2）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。第37页/共73页Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原（钼酸）呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。显色有叠加效果，使这个方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多本法可测定范围是25—250μg蛋白质。2.3lowry法（Folin—酚法）第38页/共73页Folin—酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。缺点是费时较长，要严格控制操作时间凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,CS-NH2以及Tris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰Folin—酚反应此外，酚类（干扰Folin试剂）、柠檬酸对此反应也有干扰作用。第39页/共73页注意事项

(1)Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin－酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜－蛋白质溶液。当Folin－酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸－磷钨酸试剂（酸性试剂）被破坏之前。(2)样品稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将样品酌情稀释。第40页/共73页2.4考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度实验原理1976年，M.M.Bradford发现考马斯亮蓝G—250（GoomassieBrilliantBlueG－250）与蛋白质结合后，它的光吸收峰会从465nm改变到595nm。因此，他把染色液直接加到蛋白质溶液中。根据OD595的变化就可确定蛋白质溶液的浓度。考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。本法的灵敏度很高，常量法可测定范围0.1～1.0mg/ml，微量法可测定范围为2～20ug/ml。第41页/共73页优缺点考马斯亮蓝染色法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。（why-蛋白吸附面积，疏水面积改变）第42页/共73页操作方法（一）取配好的考马斯亮蓝染色液用普通漏斗过滤，过滤好了马上用，不能久置。（二）标准曲线制作取7支试管，按照下列表格配方加样，并于2～60min之内测定OD595。（三）样品溶液中牛血清白蛋白的浓度测定取样品溶液0.5ml，加生理盐水0.5mL，染色液4.0ml，与标准曲线反应相同的时间后，测定OD595（参比溶液与标准曲线的要一致）。试管号1357911蛋白浓度（ug）020406080100标准蛋白（mL）00.20.40.60.81.0生理盐水（ml）1.00.80.60.40.20染色液（ml）4.04.04.04.04.04.0OD595第43页/共73页注意事项考马斯亮蓝溶液用之前要过滤。试管、移液管要干燥、洁净，移液要准确。先移加标准蛋白溶液，再移加生理盐水，考马斯亮蓝不要太早加入，在测吸光度前十分钟左右时加，加完马上测。比色皿用之前要先用95%乙醇泡洗（残留蓝色），再用蒸馏水冲洗干净。使用可见分光光度计前要先检查最大吸收波长是否调好。测OD595时按BSA浓度从低到高进行测定，测之前要将待测液振荡均匀。第44页/共73页2.5紫外分光光度法测定蛋白质的含量蛋白含有三种有紫外吸收的氨基酸，使其能在紫外区280nm处对紫外有吸收，吸收量与其浓度有正相关关系。由于不同蛋白含这三种氨基酸数目不同，因此一般以牛血清等蛋白做标准蛋白来做基准计算。利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱色谱分离中）广泛应用。此法的缺点是（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。第45页/共73页操作一、制作标准曲线取8支试管编号，按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。二、样品测定取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水3mL，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。

12345678标准蛋白质溶液（mL）00.51.01.52.02.53.04.0蒸馏水（mL）4.03.53.02.52.01.51.00蛋白质浓度(mg/mL)00.1250.2500.3750.5000.6250.7501.00A280

第46页/共73页2.6甲醛法测定氨基酸含量原理：氨基酸的羧基生理条件下全解离。而其氨基是弱酸，低浓度酸滴定时突跃范围小，无指示剂指示范围在突越范围内在常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使－NH3释放H+，使溶液的酸度加，（相当于氨基变成强酸）滴定终点移至酚酞的变色域内（pH9.0左右）。因此，可用酚酞做指示剂，用标准碱进行滴定。此法还可测a氨基数目（氨基氮），从而计算蛋白水解度。本方法可用于浑浊样品液。第47页/共73页操作方法1、标准样测定取3个25ml的锥形瓶，编号。向第1、2号瓶内各加入2ml0.1M的标准甘氨酸溶液和5ml水混匀。向3号瓶内加7ml水。然后向3个瓶中各加5滴酚酞指示剂，混匀后各加2ml甲醛溶液，再混匀，分别用0.1M标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。重复以上实验2次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的毫升数。取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。甘氨酸氨基氮回收率＝实际测得值/加入理论量×100公式中实际测得量为滴定第一和二号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液的ml数的平均值与三号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液的ml之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以14.008。2ml乘以标准甘氨酸的摩尔浓度再乘以14.008。即为加入理论量的mg数。上述实验只为验证滴定可靠性第48页/共73页2、未知样品测定取未知浓度的甘氨酸溶液2ml，依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。计算每ml甘氨酸溶液中含有氨基氮的mg数。氨基氮（mg/ml）＝（V末－V对）×M氢氧化钠×14.008/2式中：V末为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均值V对为滴定对照液耗用标准氢氧化钠溶液的平均值第49页/共73页2.7茚三酮比色法原理：氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。(pro黄色）水合茚三酮茚三酮第50页/共73页（1）曲线绘制准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相当于0、100、200、300、400、500、600μg氨基酸），分别置于25mL容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。第51页/共73页(2)样品测定吸取澄清的样品溶液1～4mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，用测得的A值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。第52页/共73页说明及注意事项①通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品5～10g或吸取样液样品5～10mL，置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右活性炭，加热煮沸，过滤，用30～40mL热水洗涤活性炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。②茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化第53页/共73页第三节核酸测定第54页/共73页3.1二苯胺显色法测定DNA的含量实验原理强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400μg范围内光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。第55页/共73页操作步骤1.DNA标准曲线的制定：

取10支试管，分成2组，依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2ml。另取2只试管，各加2ml蒸馏水作为对照。然后各加入4ml二苯胺试剂，混匀。于60恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处进行比色测定。取两管平均值，以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。2.制品的测定：取2支试管，各加2ml待测液（内含DNA应在标准曲线的可范围之内）和4ml二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线的制作。3.计算：

根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量，计算出制品中的百分含量。第56页/共73页3.2紫外吸收法测定DNA含量原理组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为250~270nm之间。核酸的最大吸收波长是260nm，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为20μg/ml。可以次来计算核酸样品的浓度。分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。第57页/共73页操作取DNA样品作适当稀释，配制成5~50ug/ml的溶液，用紫外分光光度计测定260nm处的光密度值（OD260），按下列公式计算，求出该样品的DNA含量。DNA浓度（ug/ml）=OD260/0.02×L×稀释倍数（L为比色杯的厚度（光径），一般为1cm。）第58页/共73页3.3核酸的定量测定——定磷法原理：在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物——钼蓝。

H3PO4+12H2MoO4→H3P(Mo3O10)4+12H2O↓还原剂钼蓝钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适范围为1—10微克无机磷。测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可以计算出核酸含量。第59页/共73页操作1．标准曲线的绘制：取12支洗净烘干的硬质玻璃试管，按下表加入标准磷溶液、水及定磷试剂，平行作两份。将试管内溶液立即摇匀，于45℃恒温水浴内保温25分钟。取出冷却至室温，于660nm处测定光密度。2．测总磷量：取4个微量凯氏烧瓶，1、2号瓶内各加0.5毫升蒸馏水作为空白对照，3、4号各加0.5毫升制备的RNA溶液（约3毫克RNA），然后各加1.0—1.5毫升5mol·L-1硫酸。继续消化，直至溶液透明为止。然后将凯氏烧瓶中的内容物用蒸馏水定量地转移到50毫升容量瓶内，定容至刻度。进行定磷比色测定。测得的样品光密度减去空白光密度，并从标准曲线中查出磷的微克数3．测无机磷量：取4支离心管，于2支中各加水0.5毫升，另2支中各加0.5毫升制备的RNA溶液，然后于4支离心管中各加0.5毫升沉淀剂，摇匀，以3500转/分离心15分钟，取0.1毫升上清液，加2.9毫升水和3毫升定磷试剂，同上法比色，由标准曲线查出无机磷的微克数第60页/共73页3.4地衣酚显色法测定RNA含量

原理核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收。RNA在20～250g范围内，光吸收与RNA的浓度成正比。地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNA和其他杂质也能给出类似的颜色。因此测定RNA时可先测定DNA含量，再计算出RNA含量。第61页/共73页操作方法一、RNA标准曲线的制定取10支试管，分成2组，依次加入0.5、1.0、1.5、2.0和2.5mLRNA标准溶液。分别加入蒸馏水使最终体积为2.5mL。另取2支试管，各加入2.5mL水作为对照。然后各加入2.5mL地衣酚试剂。混匀后，于沸水浴内加热20分钟。取出冷却（自来水中）。于670nm波长处测定光吸收值。取两管平均值，以RNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标作图，绘制标准曲线。二、制品的测定取2支试管，各加入2.5mL待测液，（样品量应在标准曲线的可测范围之内），再加2.5mL地衣酚试剂。如前所述进行测定。三、RNA含量的计算根据测得的光吸