细胞筛选个人

细胞精选一嘌呤霉素(一)确立最优精选浓度当用于精选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或拟定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。培养待转染（而不是转染后）的细胞。（精选的目的是杀灭未转染的细胞）取对数生长远的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105个/ml的细胞悬液。向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），尔后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基合适，培养箱中静置培养过夜。（这样做是为了保证在固定细胞密度下确立最正确G418药物精选浓度。）4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0,2,4,6,8,10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液代替各孔中的旧的培养基。（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。（注意：对于多数细胞种类而言，过分的嘌呤霉素能引起好多非必需的表型的反应。）每日检查细胞活力，依照细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。如细胞生长过快，能够缩短换液时间（每隔一天）。在正常的实验操作规程时，一种细胞最优精选浓度的确马上间随细胞的生长率和一般生计时间而定，大概需3到14天。在所需时间此后，嘌呤霉素的以致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。(二)转染细胞第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞交融能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。（Polybrene能够增加病毒感染的效率，可是，有时Polybrene对细胞有毒性。这时，能够用ProtamineSulfate代替Polybrene）(三)精选细胞病毒感染后24小时，能够换用含最优浓度puromycin的培养基。若是病毒对细胞有毒性，能够减少感染时间至4-6小时，尔后换用新鲜培养基，24-48小时后换加含最优浓度puromycin的培养基。最好成立一个比较皿，不加病毒液，加入Ploybrene，观察Polybrene可否对细胞有毒性；若是Polybrene没有毒性，还可以够加入puromycin，作为puromycin可否有效的比较。今后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以代替含大量死细胞的培养基。直到抗性群落能被鉴别出（一般是在精选后10到12天）。待抗性细胞长满今后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm平皿内。60mm平皿内细胞长满后，收获细胞，在蛋白或mRNA水平判断基因敲低效率。10cm培养皿内的细胞待长满后传代，第一每种牢固细胞系冻存4-5支细胞，待基因敲低判断清楚后，解冻冻存细胞，进行表型观察解析。平时情况下，由于慢病毒为复制弊端型病毒，受感染的细胞不能够产生新的病毒，因此从加入病毒颗粒开始，经过5-6次换液后，培养基内已不存在病毒颗粒，能够移至一般细胞培养室内培养研究。G418(一)确立最优精选浓度由于每种细胞对G418的敏感性不相同，而且不相同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，因此在精选从前，必然要确立G418的最正确精选浓度。G418的配制：取1gG418溶于1ml1mol/L的HEPES液，加蒸馏水定容至10ml（使G418终浓度为0.1g/ml,HEPES终浓度为100mmol/L），过滤消毒，4度保存。HEPES的化学全称为羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanicacid），分子量238.31，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间的控制溶液的pH处于恒定的范围，而对细胞无毒性作用。1mol/LHEPES的简单配置：HEPES23．83g，溶解于80ml的双蒸水中，用10mol/L的NaOH调治pH至，定容至100ml，0.22um小滤器过滤。HEPES使用终浓度为10-50mmol/L。制备精选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内按0ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml，500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml，900ug/ml、1000ug/ml浓度用无抗无血清培养基稀释G418制成精选培养基。心得：由于特点明确的细胞系G418的最正确用量还是比较牢固的，因此有时不需要在这么大范围内进行精选。比方说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的精选浓度是200ug/ml。这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行精选。培养待转染（而不是转染后）的细胞。（精选的目的是杀灭未转染的细胞）取对数生长远的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1×104个/ml的细胞悬液。向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1×103个），尔后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基合适，培养箱中静置培养。（这样做是为了保证在固定细胞密度下确立最正确G418药物精选浓度。）会合度：实质上就是指细胞占培养表面的比率，若是细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%会合，也就是会合度100%。会合度对G418精选结果的影响很大，一般精选时会合度不宜高出50%！培养6小时左右开始加药。加精选培养基精选:吸除培养孔中培养基，PBS冲洗一次，每孔中加入不相同浓度的精选培养基合适。换液：每日检查细胞活力，依照细胞活力和培养基的颜色，每三天(即每隔两天)更换精选培养基一次。如细胞生长过快，能够缩短换液时间（每隔一天）。有死细胞勤换液，能够减少对存活细胞的影响。确立最正确精选浓度：在正常的实验操作规程时，一种细胞最优精选浓度的确马上间随细胞的生长率和一般生计时间而定，在精选小G418浓度即为最正确精选浓度。

10～14天内能够杀死所有细胞的最在第一轮就精选出最正确G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在精选14天后还不能够杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。若是是400ug/ml不能够杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则能够再用

500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml

进一步精选，以确立最正确精选浓度。(二)转染细胞第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞交融能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene，终浓度为8μg/ml。将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。（Polybrene能够增加病毒感染的效率，可是，有时Polybrene对细胞有毒性。这时，能够用ProtamineSulfate代替Polybrene）3.转染后培养24小时也许更长，到细胞增加凑近70％会合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％会合时开始精选。(三)精选细胞加G418：去掉培养液，PBS洗一次，加入按最正确精选浓度配制好的G418精选培养基（无抗无血清）(实质应用时能够比最正确精选浓度高一级别)。换液：依照培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次精选培养基。当有大量细胞死亡时，能够把G418浓度减半保持精选。精选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药用完好培养基培养。待其逐渐增大后，挑出单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。单克隆判断