细胞工程植物组织器官培养技术

细胞工程植物组织器官培养技术第1页，共149页，2023年，2月20日，星期二课程初步安排：36学时

第一章绪论4个学时

第二章实验室配置及基本技术2个学时

第三章植物细胞工程的理论基础4个学时

第四章植物组织器官培养技术6个学时

第五章植物细胞培养及次生代谢产物生产3个学时

第六章原生质体培养和体细胞杂交3个学时

第七章人工种子1个学时

第八章植物种质资源离体超低温保存1个学时

第九章动物组织培养3个学时

第十章动物细胞融合与单克隆抗体4个学时

第十一章动物组织与胚胎工程1个学时

第十二章试管动物与克隆动物2个学时

第2页，共149页，2023年，2月20日，星期二第四章植物组织器官培养技术植物细胞工程的中心内容是植物细胞和组织的离体培养；从技术上说，它是一种从单细胞到植株的无性繁殖技术；从遗传的角度来讲它具有双重性，一是遗传的保守性，二是遗传的变异性。利用其保守性我们可以进行植物的快速繁殖，建立植物种质资源库以及生成有用化合物；利用其变异性我们可以进行体细胞诱变、体细胞杂交以及基因工程。第3页，共149页，2023年，2月20日，星期二一植物脱毒与离体无性繁殖技术二花药与花粉培养三植物胚胎培养第4页，共149页，2023年，2月20日，星期二一植物脱毒与离体无性繁殖技术意义植物脱毒离体无性繁殖第5页，共149页，2023年，2月20日，星期二意义任何一个优良品种均需要有一个忠实地保存其遗传性状的繁殖方法。离体无性繁殖主要是以植物营养器官为外植体，繁殖过程在人工控制的环境条件下，所以既不会造成性状分离同时还避免了病虫害的侵染，从而可以很好地保持品种的优良特性，是异交作物和无性繁殖品种繁殖的一个非常理想的途径。1、能够有效地保持优良品种特性第6页，共149页，2023年，2月20日，星期二离体繁殖周期短（1～3个月），不受季节限制，因此繁殖系数高（几十至几百倍），繁殖速度是任何其它方法所不能比拟的，所以通常将组织培养繁殖称之为快繁（rapidclonalpropagation）。2、快速繁殖新品种繁殖系数（breedingcoefficient）：也叫增殖率，指每块外植体在一个培养周期内增殖的倍数。第7页，共149页，2023年，2月20日，星期二目前受病毒为害严重的作物有：①大田作物马铃薯、甘薯、甘蔗和烟草。②蔬菜白菜、大蒜、葱、番茄和萝卜。③果树柑橘、苹果、草莓和香蕉。④花卉香石竹、各种菊花、天竺葵和紫罗兰等。3、生产无病毒种苗，防治品种退化第8页，共149页，2023年，2月20日，星期二对于那些以块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物来讲，每年相当一部分产品要用作留种。如：①大蒜留种量占产量的1/5～1/8。②马铃薯留种量占产量的1/10。③贝母留种量占产量的1/3。

4、节约耕地，提高农产品商品产出率第9页，共149页，2023年，2月20日，星期二常规营养繁殖器官多是块根、块茎、鳞茎、枝条等，体积大、含水量高，包装、运输十分不便，特别是远距离调运损失很大。离体繁殖的种苗体积小，一般自带容器，很容易携带，运输方便。

-以马铃薯为例来讲，按1亩地4000株计算，常规种薯4000个重约200kg,若用试管薯4000个则只有2kg。5、便于运输第10页，共149页，2023年，2月20日，星期二基本原理技术规程影响脱毒效果的因素植物茎尖脱毒第11页，共149页，2023年，2月20日，星期二茎尖脱毒是控制植物病毒的有效途径－药物防治病毒效率低－抗病毒育种步履艰难－组织培养的高效隔离防止了病毒的再侵染脱毒－保持种性－快繁已是一个系统技术，在许多无性繁殖作物的种苗生产上均形成了自己的体系。1、基本原理第12页，共149页，2023年，2月20日，星期二病毒在植物体内的分布具有不均匀性－1934年，White发现烟草花叶病毒（TMV）在烟草根中分布是不均匀的，越靠根尖区病毒含量越低，在根尖的顶端（生长点）不含病毒。－1949年，Limaset和Cornuet根据White的发现推测，病毒在烟草茎中的分布也可能存在与根部组织同样的情况，茎尖分生组织也应不带病毒。－1952年，Morel和Martin首先利用茎尖分生组织培养获得了大丽花和马铃薯无病毒苗，同时建立了茎尖脱毒的组织培养技术体系。第13页，共149页，2023年，2月20日，星期二能量竞争传导抑制激素抑制酶缺乏抑制因子关于植物分生组织种不带或很少带有病毒的假说第14页，共149页，2023年，2月20日，星期二（1）被脱毒植物携带病毒的诊断（2）母体材料的选择和预处理（3）茎尖分生组织培养再生植株（4）脱毒效果检测（5）脱毒苗的保存与繁殖2、基本技术规程第15页，共149页，2023年，2月20日，星期二（1）被脱毒植物携带病毒的诊断基本规程在脱毒之前，首先应该了解植物携带何种病毒，其感染程度如何，以便采取适当处理措施。这种诊断一般根据病毒病的症状特征和表现程度进行判断，必要时借助指示植物或血清学、分子生物学方法帮助鉴别。第16页，共149页，2023年，2月20日，星期二（2）母体材料的选择和预处理基本规程母体的选择：－欲脱毒材料的品种典型性－植株健康程度第17页，共149页，2023年，2月20日，星期二外植体预处理：第18页，共149页，2023年，2月20日，星期二

香石竹在38℃～40℃条件下经两个月处理可除去全部病毒。

菊花在35℃～38℃的条件下处理60天可使病毒失活。

马铃薯在37℃条件下处理10～20天能除去卷叶病毒。柑橘－速衰病毒/黄化病毒40℃/30℃条件下处理7～12周。鳞皮病毒需要在40℃/30℃条件下处理8周。啐叶病毒需要在50℃条件下处理3～22小时。洲青果病毒在50℃条件下处理30～40分钟。第19页，共149页，2023年，2月20日，星期二（3）茎尖分生组织培养再生植株外植体消毒－茎尖剥离与接种－茎尖培养基本规程第20页，共149页，2023年，2月20日，星期二－外植体消毒

在切取外植体之前茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹、蒜和马铃薯等，则用0.1%次氯酸钠或升汞表面消毒10分钟。对于这些消毒方法，工作中应灵活运用，如在大蒜茎尖培养时，可将小鳞茎在75%酒精中浸蘸一下，再用灯火烧掉酒精然后解剖出无菌茎芽。

第21页，共149页，2023年，2月20日，星期二ⅰ把茎芽置于解剖镜下（8～40倍），一只手用镊子将其按住另一只手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针要常蘸入90%酒精，并用火焰灼烧以进行消毒。但应注意解剖针的冷却，可蘸入无菌水进行冷却；

ⅱ当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，为提高成活率，可带1-2枚幼叶然后将其接到培养基上；

ⅲ接种时确保微茎尖不与其他物体接触，用解剖针接种即可。剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露时间应当越短越好，以防茎尖变干。可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，有助于防止茎尖变干。

－茎尖剥离与接种第22页，共149页，2023年，2月20日，星期二shoottipshootapexapicalmeristemapicaldome第23页，共149页，2023年，2月20日，星期二－茎尖培养将接种好的茎尖置于25℃左右的温度下,每天以16h2000～3000lx的光照条件下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠,所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月才能培养成功。

第24页，共149页，2023年，2月20日，星期二第25页，共149页，2023年，2月20日，星期二指示植物鉴定(indicatortestplants)

所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。血清鉴定(serologictest)

试管沉淀反应；免疫双扩散；酶联免疫吸附测定(ELISA)。

（4）脱毒效果检测基本规程第26页，共149页，2023年，2月20日，星期二指示植物鉴定(indicatortestplants)a.摩擦接种法：－取培养植株的叶片置于研钵中，加入少量的水和等量的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0），磨成匀奖；－将其涂抹在指示植株叶片上并在叶片上撒上金刚砂，通过轻轻摩擦使汁浸入叶片表皮细胞而又不损伤叶片；－5分钟后清水清洗叶面。将指示植株放于防蚜虫网罩的温室内然后视其病斑的有无，来判断是否脱除了病毒。如：植物液接种后如果使千日红叶片枯斑，黄花烟、心叶烟呈花叶，证明该植物体内具有马铃薯X病毒。

第27页，共149页，2023年，2月20日，星期二b.嫁接法

有些病毒不是通过汁液传播，而是通过专门的介体传播的，例如草莓黄花病毒、草莓丛枝病毒是通过一种特殊的蚜虫为介体进行传播。这种病毒的鉴定需将培养植株的芽嫁接在敏感植物上，再根据敏感植株的病症来判断是否脱除了病毒。

第28页，共149页，2023年，2月20日，星期二血清鉴定(serologictest)a.试管沉淀反应

在抗原-抗体最适比例的条件下，观察有无沉淀的产生来确定被测植株是否带病毒。试管沉淀反应操作简单，需注意的问题：

①叶绿体的自发凝聚

可用磷酸缓冲液提取汁液，再用氯仿处理除去叶绿体，（pH保持在6.5～8.5）。

②抗原抗体的比例要适当，当抗原过量会抑制沉淀的形成。第29页，共149页，2023年，2月20日，星期二絮状沉淀反应：将已知抗原与抗体在试管（如凹玻片）内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反应。环状沉淀反应：是一种定性试验方法，可用已知抗体检测未知的抗原。将已知抗体注入特制小试管中，然后沿着管壁徐徐加入等量抗原，如抗原与抗体对应，在两液界面出现白色的沉淀圆环。第30页，共149页，2023年，2月20日，星期二第31页，共149页，2023年，2月20日，星期二原理

絮状沉淀试验

抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。(flocculationtest)方法评价：敏感度较低、简便；易受抗原抗体比例影响临床意义：可测定抗原抗体反应的最适比。第32页，共149页，2023年，2月20日，星期二1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀释加入抗血清各管抗体量不变振摇混匀、37℃孵育沉淀量不同出现沉淀量最多的管为最适比例管。轻摇

絮状沉淀试验絮状沉示意图淀AgAbAg第33页，共149页，2023年，2月20日，星期二原理环状沉淀试验

把抗原液小心地加于已含抗体液的细试管液面上，当对应的抗原与抗体相遇，在界面处形成清晰的乳白色沉淀环。(ringprecipitationtest)方法评价：

敏感度较低、简便；只能定性不能定量、缺乏多对分辨力。临床意义：

鉴定血迹、诊断炭疽第34页，共149页，2023年，2月20日，星期二AbAg环状沉淀示意图沉淀管内径1.5～2mm1～5min出现沉淀环为阳性30min不出现沉淀环为阴性操作步骤第35页，共149页，2023年，2月20日，星期二b.免疫双扩散

在半固体凝胶中测定在其中扩散的抗原和抗体间的沉淀反应的方法。与沉淀法比较起来有两个优点：一是节约血清，二是汁液不用特殊处理。

步骤：

①倒胶，一般厚2mm

②打孔，多打成梅花型

③加样，加血清和汁液

一般加样后在37℃恒温过夜，即可进行结果观察。有扩散沉淀的即为带毒株，没有则为不带毒株。

第36页，共149页，2023年，2月20日，星期二原理单向琼脂扩散试验

将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测抗原在凝胶中自由扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。(singlegeldiffusiontest)方法评价：敏感度1.25mg/L、稳定、简便、重复性和线性均好第37页，共149页，2023年，2月20日，星期二琼脂单扩散试验示意图第38页，共149页，2023年，2月20日，星期二原理双向琼脂扩散试验

将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成沉淀线。(doublegeldiffusiontest)应用：1.检测未知Ag或Ab2.Ag性质分析3.Ab效价滴定4.Ag或Ab纯度鉴定第39页，共149页，2023年，2月20日，星期二琼脂双扩散试验示意图第40页，共149页，2023年，2月20日，星期二琼脂双扩散试验结果图第41页，共149页，2023年，2月20日，星期二Agargeldiffusiontest

左图示抗体与样本都起反应右图示抗体只与一个样本反应第42页，共149页，2023年，2月20日，星期二c、酶联免疫吸附测定

（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）

它是将抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合起来的一种综合性技术。即通过化学的方法将酶与抗体或抗原结合起来，形成酶标记物。然后将它与相应的抗原或抗体起反应，形成酶标记的免疫复合物。结合在免疫复合物的酶，在遇到相应的底物时，催化无色底物生成有色底物，通过比色计可以准确测定。优点是灵敏度高，测定快速，每次可以同时测定多个样品。

第43页，共149页，2023年，2月20日，星期二双抗体夹心ELISA法示意图第44页，共149页，2023年，2月20日，星期二双抗体夹心ELISA捕获试验第45页，共149页，2023年，2月20日，星期二

采用电子显微镜，可直接观察样品材料有无病毒存在，还可进一步鉴定病毒颗粒大小、形状和结构，这些特征相当稳定，因此电镜检查法既准确又有效，但需要有一定的设备和技术。

电镜检查法第46页，共149页，2023年，2月20日，星期二分子检测法

例如RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReation）将待测样品的总RNA与cDNA合成的试剂盒进行反应，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列设计引物进行PCR反应，即可以知道在寄主中是否有病毒基因的表达。

第47页，共149页，2023年，2月20日，星期二脱毒苗的离体保存与繁殖建立脱毒种苗生产繁殖网络体系木本植物建立隔离的脱毒苗母本园（5）脱毒苗的保存与繁殖基本规程第48页，共149页，2023年，2月20日，星期二母体材料病毒侵染的程度外植体的生理状态起始培养的茎尖大小3、影响脱毒效果的因素第49页，共149页，2023年，2月20日，星期二茎尖长(mm)叶原基数小植株数脱毒植株数脱毒率（％）0.1215024480.272421842.90.646400茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响第50页，共149页，2023年，2月20日，星期二离体无性繁殖是在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖的技术。跟常规繁殖方法相比，它是一种微型且快速的操作过程，因此，有时也称之为微繁(micropropagation)、快速繁殖（rapidcloneprogagation）。离体繁殖技术的应用，首先应归功于Morel，他在1960年首先建立了兰花离体繁殖的方法。目前已有近400种植物的离体繁殖获得成功，其中许多有重要经济价值的花卉（如兰花、菊花、石竹等）、水果（如草莓、无籽西瓜、葡萄、香蕉等）、经济作物（如马铃薯、甘蔗等）和林木（如桉树、杨树等）等，均已建立离体繁殖的种苗生产体系，取得了巨大的经济效益和社会效益。离体无性繁殖(propagationinvitro)

第51页，共149页，2023年，2月20日，星期二无菌培养物的建立培养物的增殖器官分化植株的形成和移栽第52页，共149页，2023年，2月20日，星期二关键环节应用范围需注意的问题第53页，共149页，2023年，2月20日，星期二外植体的选择－繁殖对象的品种典型性；－植物有自然条件下的繁殖特点。尽可能取自然繁殖器官的适当部位作外植体；－外植体的取材部位、大小和生理状态关键环节第54页，共149页，2023年，2月20日，星期二培养物的增殖－芽增殖－不定芽增殖－体细胞胚增殖－愈伤组织增殖关键环节第55页，共149页，2023年，2月20日，星期二培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖这一繁殖方式一般不需添加外源激素。如果某些植物需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。腋芽增殖第56页，共149页，2023年，2月20日，星期二从现存的芽以外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的芽称为不定芽（adventitiousbuds）特点－繁殖系数高－遗传稳定性较好－继代次数有限不定芽增殖第57页，共149页，2023年，2月20日，星期二胚状体增殖增长率高，胚的双极性免去了生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率还不高。目前除一些特殊用途外（人工种子），这一技术途径还没有用于植物的快速繁殖。第58页，共149页，2023年，2月20日，星期二所有的植物通过组织培养的方法均可以诱导形成愈伤组织，再进一步分化即可获得小植株。这一途径经历了组织培养技术的所有过程，即从愈伤组织诱导、愈伤组织增殖、芽分化、根分化到形成完整植株。它属于愈伤组织增殖

真正意义上的组织培养。一切通过其它增殖方式不能成功的植物，均可以通过愈伤组织的途径获得组培苗。愈伤组织增殖的特点是成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。对要求遗传稳定性高的作物品种，一般不采用这一途径快繁。第59页，共149页，2023年，2月20日，星期二细胞或组织培养经原球茎途径分化成植株。大部分的兰花属于这一类型，即兰花的各个部分的离体组织都能诱导形成原球茎，再经培养分化形成植株。原球茎是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官，是兰科植物在诱导时分化出的原初植物形态，具有完整植株的器官雏形，成苗容易。原球茎增殖第60页，共149页，2023年，2月20日，星期二关于试管苗生根与炼苗关键环节1.生根培养生根是获得完整植株一个关键。通过腋芽、不定芽、愈伤组织途径产生的芽长成试管苗，必须诱导生根才能移植。生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度，

提高生长素的浓度，具体应根据植物不同而定。第61页，共149页，2023年，2月20日，星期二2.生产用苗的培育

－试管苗的生长环境：无菌异养高温弱光恒温

第62页，共149页，2023年，2月20日，星期二a、壮苗

加入生长控制剂，如多效唑，B9（丁酰肼），CCC（矮壮素），其作用是使苗粗壮，叶绿素增加。

b、炼苗：将瓶盖打开打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。一般炼苗时间为10～30d。－移栽前的工作第63页，共149页，2023年，2月20日，星期二

－移栽时应注意的问题

a、防止菌类滋生

b、保持小苗水分供给

c、移栽时选择合理的种植基质

d、注意一定光照，温度条件第64页，共149页，2023年，2月20日，星期二自然无性繁殖极易感染病毒的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹和百合等。有性繁殖变异范围过大而自然条件下又不易无性繁殖的植物如非洲菊、花竹和紫罗兰等。某些难以繁殖或繁殖系数很低的植物，某些需要加速繁殖的特殊基因型如名贵花卉、优良资源、果树芽变体和转基因植物等。应用范围第65页，共149页，2023年，2月20日，星期二增殖方式的合理选择外源生长调节剂对品种典型性的影响继代次数与变异需注意的问题第66页，共149页，2023年，2月20日，星期二二花药与花粉培养概念及意义花药培养花粉及小孢子培养单倍体植株的鉴定及二倍化第67页，共149页，2023年，2月20日，星期二花瓣雄蕊萼片雌蕊花托花柄第68页，共149页，2023年，2月20日，星期二第69页，共149页，2023年，2月20日，星期二第70页，共149页，2023年，2月20日，星期二花药培养（antherculture）属于器官培养范畴。花粉培养（pollenculture）也称为小孢子培养（microsporeculture）,属于细胞培养类型。

概念及意义第71页，共149页，2023年，2月20日，星期二花药培养与小孢子培养目的一样，为了获得单倍体－一定条件下，花药培养与小孢子培养可以得到再生植株。这样的植株只含有一套染色体，数目和配子体相同，因而是单倍体植株。－单倍体植株经过染色体加倍就成为加倍单倍体植株（doubledhaploidplants,DH植株）或称纯合二倍体。第72页，共149页，2023年，2月20日，星期二hexaploid植物其haploid为triploid

普通小麦2n＝6x＝42n＝3x＝21octoploid植物其haploid为tetraploid

草莓2n＝8x＝56n＝4x＝28第73页，共149页，2023年，2月20日，星期二

单倍体植物与其二倍体相比较，有三个明显特点：－体细胞染色体数减半－生长发育弱，体形小，各种器官明显减小－雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代第74页，共149页，2023年，2月20日，星期二

纯合二倍体不仅育性可以恢复且在遗传上是纯合的。加倍单倍体育种（DH育种）技术在植物遗传育种上的价值体现在：－加快常规育种速度－提高常规育种选择效率第75页，共149页，2023年，2月20日，星期二

常规育种，杂种F2代开始分离，继续自交，通过不断选择和淘汰，一般需到F5～F6代才能得到纯合后代。花药、花粉培养可得到单倍体植株，染色体加倍后即获得纯合二倍体。从杂交到获得纯合株系，只需二个世代。因此，可以缩短育种年限3～4个世代。第76页，共149页，2023年，2月20日，星期二

在常规杂交后代中，存在显、隐性的干扰从而影响选择的准确性和效果，在加倍单倍体的后代中只有一种基因型和表现型，不存在显性性状掩盖隐性性状的问题，不良性状在当代即可表现出来，便于淘汰。因此，利用花药培养的单倍体育种技术可提高选择效率。第77页，共149页，2023年，2月20日，星期二

小麦高秆（D）对矮秆（d）为显性，抗锈病（T）对不抗锈病（t）为显性，现在有纯合的高秆抗锈病的小麦（DDTT）和矮秆不抗锈病的小麦（ddtt），问怎样才能得到矮秆抗病的优良品种（ddTT）？第78页，共149页，2023年，2月20日，星期二Ｐ高抗矮不抗F1

高抗F2DDTTddttDdTtddTt高抗高不抗矮抗矮不抗ddTT矮抗ddTTddTt矮抗ddTT矮抗矮抗矮不抗ddTtddTT杂交自交选优自交F3选优第79页，共149页，2023年，2月20日，星期二选育纯种选用纯合亲本杂交利用现有基因重新组合选种

连续自交第80页，共149页，2023年，2月20日，星期二Ｐ高抗矮不抗Ｆ１高抗DDTTddttDdTtdtdT杂交F1植株花粉单倍体幼苗DTDt花药离体培养dtdTDTDt秋水仙素处理ddttddTTDDTTDDtt正常植株（纯合子）矮抗第一年第二年矮杆抗病新品种第三年第81页，共149页，2023年，2月20日，星期二单倍体途径的应用潜力：－迅速获得纯合型材料，缩短育种年限，提高选择效率－获得育种中间材料－与诱变育种相结合可以提高诱变频率－与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义－作为遗传工程受体更为有效－用作基础遗传研究的各个领域第82页，共149页，2023年，2月20日，星期二flowerbud花芽anther花药antherculture花药培养haploidcallus单倍体愈伤组织haploidembryo单倍体胚haploidplantlets单倍体植株colchicinetreatment秋水仙素处理homozygous纯合的,同型结合的heterozygous杂合的，杂合子的diploid二倍体donorplant供体植株，母体植株第83页，共149页，2023年，2月20日，星期二首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和Maheshwari(1964,1966)。目前已有250多种高等植物花药培养成功。我国花药培养获得单倍体的技术途径在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。

我国通过花药培养途径培育出大面积推广应用的水稻品种“寒花早”、“中花8号”等，小麦品种“京花1号”。同时还获得大批具有育种价值的单倍体系。花药培养第84页，共149页，2023年，2月20日，星期二概念花药培养（antherculture）指把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成为植株的过程。第85页，共149页，2023年，2月20日，星期二基本环节外植体选择－外植体(花蕾)预处理－外植体消毒－花药分离与接种－诱导培养－分化培养-移栽第86页，共149页，2023年，2月20日，星期二供试材料的遗传背景－目前，通过花药培养成功获得单倍体植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科和百合科等。－不同植物类型和同一类型的不同品种对花药培养的反应也是不同的。技术要点外植体选择第87页，共149页，2023年，2月20日，星期二供试材料的生理状态在多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药诱导频率高。草本植物生长健壮且处于生殖生长高峰期的花药诱导频率较高，而徒长或是营养不足的植株花药培养的诱导频率较低。第88页，共149页，2023年，2月20日，星期二花粉发育时期四分体—

小孢子—

单核花粉—

双核花粉最适期－Sunderland(1971)对烟草不同花粉发育时期的培养反应进行了观察：花粉发育时期胚状体诱导频率(％)

减数分裂期0

单核早期14

单核晚期40

双核早期55第89页，共149页，2023年，2月20日，星期二外植体预处理大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。－烟草、茄子3～5℃下72小时－水稻10℃下10～14天－柑橘3℃下5～10天－马铃薯4℃下48小时技术要点第90页，共149页，2023年，2月20日，星期二低温处理的作用：－低温能使花粉保持较长的生活力，延缓花药壁组织的衰老和降低花粉的死亡率，从而增加有效存活的花粉数量，使较多的小孢子完成从配子体到孢子体发育类型的转变。第91页，共149页，2023年，2月20日，星期二挑出适宜培养的花蕾或幼穗，一般先将花蕾或幼穗的表面用70%乙醇浸泡1min，然后在0.1%升汞中浸泡3～5min，无菌水冲洗3～5次。若花蕾包裹严密内部一般是无菌的，只需要用蘸有70%酒精的棉球对叶鞘或花蕾进行表面擦拭就可达到灭菌的目的。

外植体的表面消毒技术要点第92页，共149页，2023年，2月20日，星期二

将消毒过的材料置于超净工作台上，无菌剥取花药进行接种。在剥取花药时，应注意在整个操作过程中尽可能避免花药受到损伤，否则常常会刺激花药壁形成愈伤组织。若是花药较大的材料，可用解剖刀或镊子剥开花蕾，取出花药。如果是花器很小，可能需借助解剖镜夹取花药，或只是把花被去掉，将其余部分接种在培养基上。接种时尽量减少花药在空气中的暴露时间，将花药水平地放在培养基上进行培养。接种密度因培养方式而异。

花药分离与接种技术要点第93页，共149页，2023年，2月20日，星期二花药培养培养基－花药培养常用的基本培养基：

MS（Murashigc&Skoog，1962）

Nitsch(Nitsch，1969)N6(朱至清，1974)B5(Gamborgetal，1976)－附加成分：蔗糖,激素。技术要点第94页，共149页，2023年，2月20日，星期二蔗糖在花药诱导培养阶段的主要功能是:提供C源；维持适宜的渗透压；抑制花药壁分裂而促进花粉细胞的分裂番茄花药培养愈伤组织诱导频率对蔗糖浓度的反应

蔗糖浓度2％3％4％6％10％13％17％

诱导频率5％10％12％18％25％45％8％第95页，共149页，2023年，2月20日，星期二

在花药的诱导培养期间（脱分化），需要有较适宜的细胞分裂素和生长素配比，从而有效地诱导花粉细胞启动分裂，同时控制二倍体细胞的分裂。常用的激素：

-细胞分裂素类：BA、KT、玉米素

-生长素类:NAA、IAA、2,4-D

第96页，共149页，2023年，2月20日，星期二高秀云等对茄子的研究表明：MS＋2,4-D0.5mgl-1＋KT1mgl-1n93.8%2n6.2%MS＋2,4-D2mgl-1＋KT1mgl-1n64,1%2n35.9%高浓度的2,4-D主要诱导花药形成愈伤组织，而不能形成胚状体，从而增加了二倍体细胞发育的机会。第97页，共149页，2023年，2月20日，星期二培养条件－温度和光照

温度：25～28℃下进行花药和花粉培养。－柑橘在20℃以下完全不能形成胚状体，愈伤组织形成亦很少；温度提高到21～25℃时便有胚状体形成，而当温度提高到26℃以上时又完全不能够形成胚状体。－油菜若将接种后的花药在30℃条件下培养2～3天，可显著提高花粉胚的形成率。－小麦在33℃条件下培养3～5天可提高成愈率和绿苗率第98页，共149页，2023年，2月20日，星期二光照：先弱后强，光照1000～2000lx、光周期14h条件下进行分化培养；关于光质对花药和花粉培养影响的研究较少。第99页，共149页，2023年，2月20日，星期二培养方法

－固体培养－液体培养－双层培养－分步培养－条件培养第100页，共149页，2023年，2月20日，星期二固体培养Antherandhaploid

plantletsonasolid

mediumcontaining

activatedcharcoal第101页，共149页，2023年，2月20日，星期二Antherandhaploid

plantletsonaliquid

mediumcontaining

activatedcharcoal液体培养第102页，共149页，2023年，2月20日，星期二在3.5cm小培养皿中铺加一层（1ml）琼脂培养基，待固化后，在其表面再加入0.5ml液体培养基。优点在于花药在培养早期可以从活性高的液体培养基中汲取营养，花粉胚长大后又不会沉没，可以在通气良好的条件下分化成植株。双层培养第103页，共149页，2023年，2月20日，星期二将花药接种在液体培养基上进行漂浮培养，花粉可以从花药中自然释放并散落在液体培养中，然后及时用吸管将花粉从液体培养基中取出，植板于琼脂培养基上，使其处于良好的通气环境，使得花粉植株的诱导率大大提高。分步培养第104页，共149页，2023年，2月20日，星期二用预先培养过花药的液体培养基再次进行花药培养，可使花药培养效率大大提高。条件培养基不存在种的特异性，例如培养过小麦花药的培养基对大麦同样有效果。

条件培养基培养第105页，共149页，2023年，2月20日，星期二Sunderland(1978)明确提出药壁因子作用假设，认为当花粉对花药壁因子接受能力最大的时期与花药壁因子作用的最大时期一致时，植株的花药最易被诱导。-组织学研究也证实药壁因子在诱导花粉胚中起着关键作用。在烟草中，只有原来贴靠着花药壁的花粉粒才能顺利发育成花粉胚。在天仙子中，也只有处在药室外围紧靠绒毡层的花粉能够发育成花粉胚。关于药壁因子第106页，共149页，2023年，2月20日，星期二第107页，共149页，2023年，2月20日，星期二

离体培养的花药中小孢子改变发育途径，经过连续多次细胞分裂发育为孢子体的过程，通常称为雄核发育（androgenesis)：花药培养中单倍体形成的途径第108页，共149页，2023年，2月20日，星期二培养初期花粉发育的途径根据Sunderland、Wicks和Norreel的研究，可以把早期花粉发育分为三类：(1)单核正常非均等分裂形成一个生殖核和一个营养核以后，或一个生殖核发育，或一个营养核发育，或二者均等发育。(2)单核均等分裂为两个子细胞，以后不断发育。(3)异常多核花粉粒发育有些小孢子核连续分裂3次，形成类似8核胚囊的现象，称为花粉胚囊。第109页，共149页，2023年，2月20日，星期二单倍体植株形成途径－通过胚状体形成单倍体植株－通过愈伤组织形成单倍体植株

第110页，共149页，2023年，2月20日，星期二-通过早期的分裂，单个花粉粒细胞形成了一个多细胞团，这种多细胞团从花药壁中释放出来后按照合子胚的途径发育，经过球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚的发育过程。

-由胚状体的发育过程可以看出，一个花粉粒只形成一个胚状体，一个胚状体萌发出一个植株。也就是说，通过胚状体形成的植株均是来自单个花粉粒。通过胚状体形成单倍体植株第111页，共149页，2023年，2月20日，星期二-花粉粒早期分裂的细胞团如果一直保持无序分裂状态，会形成多细胞团的愈伤组织，进一步分化成植株。目前为止，大多数花药培养成功的植物都是由这一途径产生。

-通过愈伤组织形成的植株其倍性常不只是单倍体也有二倍体，有时还有多倍体、混倍体等。通过愈伤组织形成单倍体植株第112页，共149页，2023年，2月20日，星期二NAA浓度对甜椒品种“二猪咀”花药诱导胚状体的影响NAA(mgl-1)0.251.02.0embryoid(%)6.451.91.11callus6.79.212.9第113页，共149页，2023年，2月20日，星期二

植株再生途径与倍性

植株来源

倍性

细胞类型embryoidn单个花粉粒callusn/2n/2n+单个或多个花粉粒花粉细胞与花药壁细胞等第114页，共149页，2023年，2月20日，星期二①诱导频率低。频率最高的烟草也只有30%，低的只有百分之几，千分之几；

②体细胞（花丝、药壁、药隔）干扰问题；

③药壁绒毡层细胞对花粉发育的作用以及如何用合成培养基代替毡绒层的作用还不十分清楚，目前培养基成分带有一定的盲目性；

④白化苗问题

存在的问题第115页，共149页，2023年，2月20日，星期二禾谷类植物的花药培养中经常会出现白化苗－愈伤组织分化绿苗或白苗的特性是相对稳定的，绿苗和白苗混生的现象只占极少数。－影响花粉白苗形成的因素可能包括：供体植物的基因型、花粉发育时期、培养基成分和培养条件等。－染色体结构的变异可能是白化苗的成因。第116页，共149页，2023年，2月20日，星期二概念花粉培养（pollenculture）即小孢子培养（microsporeculture）,是从花药中分离出花粉粒使之成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉粒脱分化进而发育成完整植株的过程。花粉及小孢子培养第117页，共149页，2023年，2月20日，星期二关键环节

取材时期的确定－花粉的分离－花粉的培养第118页，共149页，2023年，2月20日，星期二四分体—单核早期—单核晚期—双核早期—双核晚期—三核期－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－小孢子花粉粒－－－－－－－－－－－－花粉培养花药培养技术要点取材时期的确定第119页，共149页，2023年，2月20日，星期二

－机械分离法－花药漂浮自然释放法

技术要点

花粉或小孢子的分离第120页，共149页，2023年，2月20日，星期二

培养方法技术要点－哺育培养－看护培养－微室培养

第121页，共149页，2023年，2月20日，星期二第122页，共149页，2023年，2月20日，星期二a、花药培养容易受药壁、药隔、花丝等体细胞组织的影响，再生植株会出现不同倍性的个体，而花粉培养可以克服这一不足。

b、能更好调节控制核发育的各种因子，而且可直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程，为研究雄核生理生化等问题提供方便。

c、原则上讲，从花粉培养能得到更多的花粉植株。

花粉培养的优点第123页，共149页，2023年，2月20日，星期二

与其他器官的培养技术相比，花粉粒培养还不成熟，影响培养的效果可能很多，要非常系统归纳还不可能，简述如下：

A在培养前分离的花药应多次洗涤，否则其生长和形态发生将受影响，不洗涤的花粉不能生长或只能形成愈伤组织

B冷处理已广泛用来提高花粉雄核发育的频率

C培养基中增加蔗糖和肌醇的浓度能明显提高雄核发育的频率。

第124页，共149页，2023年，2月20日，星期二单倍体植株的鉴定及二倍化

－形态学鉴定－染色体分析鉴定方法第125页，共149页，2023年，2月20日，星期二

－秋水仙素处理加倍－继代加倍－创伤法加倍

单倍体植株的二倍化第126页，共149页，2023年，2月20日，星期二三植物胚胎培养根据培养中所取外植体部位及取材时期不同，植物胚胎培养包括：胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。胚珠和子房培养由于取材时期不同，包括受精以后的胚珠子房培养、未受精胚珠和子房培养。第127页，共149页，2023年，2月20日，星期二胚培养胚乳培养第128页，共149页，2023年，2月20日，星期二植物胚培养(embryocultureofplants)胚培养在实践中的意义－克服杂交育种中杂种胚的早期夭折－克服珠心胚干扰，提高育种效率－理论研究领域的应用1.胚培养的意义和类型第129页，共149页，2023年，2月20日，星期二胚培养的类型－成熟胚(matureembryo)培养－幼胚(immatureembryo)培养第130页，共149页，2023年，2月20日，星期二成熟胚培养－成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。培养较易成功，在含有大量元素和糖的培养基上能正常生长成幼苗。由于种子外部有较厚种皮包裹不易造成损伤，易于进行消毒，因此，将成熟或未成熟种子用70%酒精进行几秒种的表面消毒，再用无菌水冲洗3～4次，然后在无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养。

第131页，共149页，2023年，2月20日，星期二幼胚培养－幼胚是指子叶期以前的幼小胚，由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，因此，其研究和应用越来越深入和广泛。随着组织培养技术不断完善，幼胚培养技术也在进步，现在可使心形期胚或是更早期的长度仅0.1～0.2mm的胚生长发育成植株。

第132页，共149页，2023年，2月20日，星期二Hanning早在1904年就培养了萝卜和辣根菜的胚，发现离体胚可以充分发育，并且提前萌发形成小苗，这是世界上胚培养最早获得成功的一例。Laibach在1925～1929年间，培养亚麻种间杂种幼胚，成功地获得了种间杂种，首次证实了这种方法在实际应用中的价值。李继侗，1933年在银杏培养中发现了胚乳提取物能够促进银杏离体胚的生长。为后人使用植物胚乳汁液、幼嫩种子及果实提取液等天然物质促进培养物的生长具有启示作用。2.幼胚培养

第133页，共149页，2023年，2月20日，星期二－取材时期－幼胚剥离－培养条件与控制幼胚培养的关键技术第134页，共149页，2023年，2月20日，星期二A)GlobularB)heartshapedC)torpedo

大多数幼胚培养成功的实例证明，适宜于幼胚培养的胚发育时期多为球形胚至鱼雷形胚。以幼胚抢救为目的的胚培养取材，必须在胚退化衰败之前。

取材时期第135页，共149页，2023年，2月20日，星期二－幼胚是一种半透明、高粘稠状组织，剥离过程中极易失水干缩，一定要注意保湿，且操作要迅速。－有关胚发育的细胞学和生理生化研究表明，胚柄积极参与幼胚发