第四节植物数量性状图位克隆方法

第四节植物数量性状图位克隆方法第1页，共30页，2023年，2月20日，星期二数量性状变异的遗传基础生物自然群体在形态、生理、行为和抗性等性状上存在极大的变异，表现为数量性状遗传。数量性状涉及多个位点，每一位点的效应微小，存在等位基因的变异，等位基因的效应通过每个个体所处的环境表现出来。P=G+E+G×E当前生物学的一个重大挑战是明确数量性状变异的遗传基础第2页，共30页，2023年，2月20日，星期二数量性状位点(QTL)QuantitativeTraitLocus(QTL)是生物基因组上的某个区段，它含有一个或多个基因，影响数量性状的变异。QTL可以通过多态性分子标记与性状的连锁关系而确定下来，即QTL定位。第3页，共30页，2023年，2月20日，星期二QTL初定位

-查找QTL在基因组上的大概位置

初定位的群体：连锁群体和关联群体：连锁群体：人工群体，利用杂交过程中产生的重组，通过分子标记多态性与性状变异的连锁关系定位QTL。关联群体：自然群体，利用进化或育种过程中所积累的重组和变异，通过基因组中的连锁不平衡（LD）来确定遗传多态性与性状变异的关系。缺点：定位结果很大程度上依赖于群体结构和等位基因频率。第4页，共30页，2023年，2月20日，星期二连锁群体的基因组结构和QTL初定位连锁群体：临时性分离群体：自交群体（如F2、F3）和回交群体（BC1、BC2）等。永久性分离群体：重组自交系群体(RIL)和加倍单倍体群体(DH)等。在分离群体基础上筛选的极端个体群体。第5页，共30页，2023年，2月20日，星期二123456789101112123456789101112123456789101112F2RIL表型鉴定以单株或其后代家系为基础，准确性不高，不能重复试验。简单，遗传变异丰富，可以同时估计加性和显性效应。后代稳定，不发生分离，鉴定性状以纯合株系为基础，准确性高。群体准备周期长，只能估计加性效应。早代多次互交，增加重组。第6页，共30页，2023年，2月20日，星期二F2群体QTL初定位0/2:homozygousgenotypes1:heterozygousgenotype第7页，共30页，2023年，2月20日，星期二关联群体的基因组结构和QTL初定位第8页，共30页，2023年，2月20日，星期二关联群体QTL初定位第9页，共30页，2023年，2月20日，星期二Diagramofgenomereshufflingbetween25diversefoundersandthecommonparentandtheresulting5000immortalgenotypes.YuJetal.Genetics2008;178:539-551连锁-关联群体的基因组结构和QTL初定位第10页，共30页，2023年，2月20日，星期二PolandJAetal.PNAS2011;108:6893-6898用NAM群体鉴定出了29个QTL，抗性等位基因用红色，感病等位基因用绿色。公共亲本B73自交系和25个核心自交系的小斑病抗性第11页，共30页，2023年，2月20日，星期二QTL精细定位

-确定QTL在基因组上的准确位置

在禾谷类作物中，许多影响重要农艺性状的QTL已被定位，相比较而言，克隆到基因却非常少。一般来讲，初定位的QTL置信区间在10-30cM，包含几百个基因。不清楚QTL是对应一个基因？还是多个紧密连锁的基因?如果对应有多个基因，基因的效应相同?还是相反？是否累加?等等必需精细定位QTL，克隆对应的基因。第12页，共30页，2023年，2月20日，星期二QTL是通过统计分析得到的，定位在染色体某一置信区间内。增加分子标记和完善统计分析软件，对置信区间的缩小并不是很有效。精细定位，即在QTL初定位基础上，针对目标区间构建遗传背景一致的次级遗传分离群体，把复杂性状QTL界定于更小的基因组区域内。将QTL作为一个主Mendelian因子来进行精细定位。QTL精细定位的可行性第13页，共30页，2023年，2月20日，星期二QTL精细定位决定于三个基本要素：1)高密度标记；2)关键重组个体；3)重组个体性状的准确鉴定。目标：QTL--QTG--QTN

Locus-Gene-NucleotideQTL精细定位三要素第14页，共30页，2023年，2月20日，星期二QTL精细定位—标记密度基因组大规模重测序、SNP芯片、比较基因组学等保证在目标基因区域获得高密度的分子标记。禾谷类作物的基因组重测序产生了海量的SNP信息，用于开发目标基因区域的高密度分子标记。玉米的HapMap计划(Goreetal.2009)有160万SNP。水稻中，Huangetal.(2010)检测到360万非冗余的SNP位点，平均9.32SNPs/kb。第15页，共30页，2023年，2月20日，星期二QTL精细定位—关键重组个体成功的QTL精细定位依赖于关键重组个体，也即在目标QTL区域有高频率的染色体交换发生。重组频率在染色体的不同区域变异很大，产生所谓的重组热点和重组冷点区域。如QTL位于重组热点，就易获得关键重组个体；不然就需要很大的分离群体，或连续多代，或组配多个组合等方法筛选。染色体不同区域重组频率的高低与着丝粒位置、染色体结构、亲本在QTL区域的序列差异等均相关。第16页，共30页，2023年，2月20日，星期二玉米染色体的重组频率和基因密度分布K.Fengleretal.,inpress,PlantGenome第17页，共30页，2023年，2月20日，星期二通过控制群体结构和后代测定等手段来消除遗传背景的影响，同时增加重组机会。在目标QTL区间建立高分辨率的分子标记图谱，分析目标QTL与标记的连锁关系。主要采用近等基因系(Near-isogeniclines,NILs),染色体片段代换系(chromosomesegmentsubstitutionlines，CSSLs)或导入系(introgressionline,ILs),及基于重组自交系衍生的杂合自交家系(heterogeneousinbredfamily,HIF)或剩余杂合体(residualheterozygousline,RHL)。QTL精细定位—性状的准确鉴定第18页，共30页，2023年，2月20日，星期二利用单QTL-NIL群体的精细定位。筛选在目标QTL区间具有差异、遗传背景完全一致的QTL近等基因系(nearisogenicline，NIL)，配组构建群体，或者筛选在目标区间呈杂合型、遗传背景呈纯合型的单株，自交建立分离群体，通过对分离群体单株或单株自交后代测定，分析表型差异，精细定位目标QTL区间。Advantage:IdenticalbackgroundDisadvantage：Laborious&LongtimeconsumedQTL精细定位策略—单QTL-NIL第19页，共30页，2023年，2月20日，星期二QTL1fromP1isobtainedbyMASusingP2asarecurrentparent.TheresultingNIL1hasachromosomesegmentthatincludesQTL1,butisotherwiseidenticaltotheP2geneticbackground.第20页，共30页，2023年，2月20日，星期二第21页，共30页，2023年，2月20日，星期二染色体片段代换系CSSLs，即在受体(供体)亲本的遗传背景中建立供体(受体)亲本的“基因文库”，代换系覆盖全基因组且相互重叠。由代换系组配的分离群体消除了大部分遗传背景的干扰及QTL之间的互作，可提高QTL定位的效率和精度，从而可进一步缩小QTL区间。QTL精细定位策略—CSSLs第22页，共30页，2023年，2月20日，星期二CSSL(ChromosomeSegmentSubstitutionLine)第23页，共30页，2023年，2月20日，星期二基于重组自交系（RIL）衍生的杂合自交家系(heterogeneousinbredfamily，HIF)或剩余杂合体(residualheterozygousline,RHL)的QTL精细定位。RIL群体是连续自交产生的，随着代数的增加，染色体上的大多数位点逐步纯合，一般到F5代就只有6.25％的位点处于杂合状态。在QTL初定位基础上，利用分子标记从RIL群体中筛选目标QTL杂合而背景纯合的RHL自交，构建类似单QTL-NIL群体。从RIL群体中筛选，时间短，花费少，现在较多地用于QTL精细定位。QTL精细定位策略—HIF或RHL第24页，共30页，2023年，2月20日，星期二RHL(ResidualHeterozygousLine)第25页，共30页，2023年，2月20日，星期二玉米抗病QTL精细定位中遇到的问题玉米的抗病大多数属数量性状遗传，优良抗病基因多为稀有基因。因此，分离不同的抗病基因需要组配不同的群体。由于玉米染色体结构复杂性，抗病QTL位点的关键重组个体不易获得。抗病性状在年份、地点间的变异很大，关键重组个体的性状鉴定困难。现有的QTL精细定位方法不适用第26页，共30页，2023年，2月20日，星期二1)Variabilityinsymptomdevelopment

2)DifficultyinphenotypicevaluationGenotypeEnvironmentsGenotypeEnvironmentsPathogenMorphologicalTraitsDiseaseresistance第27页，共30页，2023年，2月20日，星期二基于重组个体后代测定的连续精细定位方法Recurrentparent×F1RecurrentparentMASBC2F1×RecurrentparentBC3F1ProgenyRecurrentparentBC3F1RecombinantsMASBCn+1F1ProgenyBCnF1RecombinantsDonorparentProgenytestingandMAS××F2

QTLanalysisBC1×RecurrentparentRecurrentparent×ProgenytestingandMASCompletionoffinemappingThesequentialQTLfine-mappingprocedureMAS:Marker-assistedselectionProgenytesting:Investigationofbothgenotypeandphenotypeforeachprogeny第28页，共30页，2023年，2月20日，星期二R:118S:132R:235S:74ResistantR:166S:139R:177S:133P-value<0.001P-value:0.675SusceptibleProgenyevaluationtodetectaQTLinthed