第九讲凝胶电泳技术

（优选）第九讲凝胶电泳技术ppt现在是1页\一共有48页\编辑于星期一凝胶电泳(gelelectrophoresis)技术现在是2页\一共有48页\编辑于星期一核酸分子杂交技术现在是3页\一共有48页\编辑于星期一蛋白分子杂交技术现在是4页\一共有48页\编辑于星期一细胞转化（原核）/转染（真核）现在是5页\一共有48页\编辑于星期一PCR扩增现在是6页\一共有48页\编辑于星期一DNA测序DNA测序仪现在是7页\一共有48页\编辑于星期一蛋白测序现在是8页\一共有48页\编辑于星期一文库构建现在是9页\一共有48页\编辑于星期一酵母双杂交现在是10页\一共有48页\编辑于星期一RNA干扰(RNAi):转录后基因沉默技术现在是11页\一共有48页\编辑于星期一第一节凝胶电泳技术凝胶电泳（Gelelectrophoresis）

是以凝胶为载体，以电流为驱动，用于分离不同大小、形状、等电点等分子的技术。凝胶电泳通常用于分析用途。但也可以作为制备技术，如在使用质谱(MS)、PCR、克隆、DNA测序、免疫印迹等检测之前用于提纯分子。现在是12页\一共有48页\编辑于星期一一、核酸的凝胶电泳

基本原理

在buffer为PH8.0时，带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定介质（琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。

现在是13页\一共有48页\编辑于星期一电泳槽电泳仪梳子电泳槽制胶板正极电源插孔负极电源插孔电源线电泳槽现在是14页\一共有48页\编辑于星期一现在是15页\一共有48页\编辑于星期一现在是16页\一共有48页\编辑于星期一

电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型

①分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移率要快；

②同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比线性DNA分子要快，线性DNA分子比开环DNA分子要快。

现在是17页\一共有48页\编辑于星期一图2线性DNA电泳图现在是18页\一共有48页\编辑于星期一凝胶电泳的分辨力：

与凝胶的类型和密度相关

琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间;聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间现在是19页\一共有48页\编辑于星期一聚丙烯酰胺凝胶电泳图（高分辨率，1bp差异可区分）琼脂糖凝胶电泳图现在是20页\一共有48页\编辑于星期一（一）琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。现在是21页\一共有48页\编辑于星期一LMP琼脂糖熔点：62～65℃

熔解后，在37℃可保持液态数小时；在25℃可保持液态约10min应用：直接酶切，回收DNA分子；在65℃下将LMP琼脂糖凝胶熔化；加入过量的酚抽提DNA；离心获得含DNA分子的上清液。现在是22页\一共有48页\编辑于星期一琼脂糖凝胶电泳图现在是23页\一共有48页\编辑于星期一琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：1×

TAE或TBE凝胶的含量：根据检测的DNA大小加DNA样品：<1μg，指示剂电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间染色和观察：溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。能看到0.05

μg的微量DNADNA的片断大小与荧光强度成正比

现在是24页\一共有48页\编辑于星期一TAE:电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。

TBE:缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好（常用）。TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。电泳反冲液现在是25页\一共有48页\编辑于星期一SeparationRangeVs.%Agarose现在是26页\一共有48页\编辑于星期一注意：EB（Ethidiumbromide，溴化乙锭）为强致癌物！！！现在是27页\一共有48页\编辑于星期一Agarosegelelectrophoresis现在是28页\一共有48页\编辑于星期一现在是29页\一共有48页\编辑于星期一现在是30页\一共有48页\编辑于星期一现在是31页\一共有48页\编辑于星期一凝胶成像仪现在是32页\一共有48页\编辑于星期一

用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算

现在是33页\一共有48页\编辑于星期一二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:

1、DNA的分子大小:

线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

现在是34页\一共有48页\编辑于星期一2、琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

现在是35页\一共有48页\编辑于星期一3、DNA分子的构象

当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动快,而线状双链DNA移动要慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。

现在是36页\一共有48页\编辑于星期一4、电源电压

在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。

现在是37页\一共有48页\编辑于星期一5、嵌入染料的存在

荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。

现在是38页\一共有48页\编辑于星期一6、离子强度影响

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

现在是39页\一共有48页\编辑于星期一第二节分子杂交

一Southern杂交二Northern杂交三

菌落原位杂交四Western杂交现在是40页\一共有48页\编辑于星期一分子杂交

(moleculehybridization)【分子杂交】是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子，以及其相对分子量大小。根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、Northern杂交和Western杂交，及由此演化的斑点杂交和菌落杂交等。

现在是41页\一共有48页\编辑于星期一分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行，也可能在蛋白质与蛋白质之间进行。【核酸分子杂交】是指核酸分子(DNA或RNA)在变性以后，在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。现在是42页\一共有48页\编辑于星期一现在是43页\一共有48页\编辑于星期一探针标记方法体内(invivo)标记是将放射性标记的化合物作为代谢底物加到活细胞培养体系中去，经细胞的合成代谢而使核素掺入到新合成的核酸分子中去。体外标记法分为化学法和酶法：①化学法。最常用的是125I标记和光敏生物素(photobiotin)标记。②酶法也叫酶促标记法，将标记物预先标记到核苷酸(NTP或dNTP)分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺人到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。

现在是44页\一共有48页\编辑于星期一(1)缺口平移法：DNaseI是在两条链的不同部位随机打开缺口，从而使两条链都被核素均匀地标记，使得标记的DNA具有较高的放射比活性。3种三磷酸脱氧核糖核苷酸如dATP、dTTP、dGTP，一种核素标记的核苷酸32P—dCTP，待标记DNA片段。在极微量DNA聚合酶的作用下，在双链DNA分子的一条链上随机切开若干个缺口而不是切断DNA或将其降解，然后，大肠杆菌DNA聚合酶I在切口的3’—OH端逐个加入新的核苷酸，同时由于该酶具有5，—3’外切酶的活性，它同时切除5，端游离的核苷酸，3’端核苷酸的加入和5，端核苷酸的切除同时进行导致切口沿着DNA链移动。现在是45页\一共有48页\编辑于星期一现在是46页\一共有48页\编辑于星期一(2)随机引物标记法：随机引物(randomprimer)是人工合成的长度为6个核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物，它们的顺序是根据计算机分析的生物基因组DNA6核苷酸排列的多种可能性而设计的。