第二次讨论第一题

第二次讨论第一题第1页，共48页，2023年，2月20日，星期一第2页，共48页，2023年，2月20日，星期一PP宝藏T蛋白质双向电泳原理蛋白质双向电泳方法蛋白质双向电泳在医学的应用Westernblot第3页，共48页，2023年，2月20日，星期一

即蛋白质印迹法（免疫印迹试验)。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。westernblot第4页，共48页，2023年，2月20日，星期一为更清楚地讲清采用蛋白质印迹法，下面我们通过一个实验（用蛋白质印迹法分析小鼠肝，肾两个器官中的CYP1A1（细胞色素的一种）的含量。）来为大家介绍蛋白质印迹法的应用主要在于蛋白质检测第5页，共48页，2023年，2月20日，星期一小鼠禁食过夜，断头处死，迅速剖开腹腔，取出肝、肾分别称重↓按1g组织中加入冰预冷的10ml裂解液，10mMPMSF（苯甲基磺酰氟）1ml冰上制成10％的组织匀浆↓取1ml匀浆，4℃、离心30分钟↓小心吸取上清液↓取少量上清液进行蛋白定量，余下的-20℃保存备用注意事项,样品裂解或匀浆处理不彻底，以及蛋白质沉淀不完全，，可能导致得率过低1.样品制备第6页，共48页，2023年，2月20日，星期一考马斯亮蓝G—250是一种蛋白质染料，最大吸收峰在465nm,当它与蛋白质以范德华力结合形成考马斯亮蓝G—250蛋白质复合物，其最大吸收峰改变为595nm，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。按下表操作。绘制标准曲线，计算测定管的浓度2.蛋白质定量（考马斯亮蓝染色法）第7页，共48页，2023年，2月20日，星期一装配好制胶玻璃板↓按下列配方配制12％的分离胶：将表中的前四项组分混匀后，再加入APS和TEMED（四甲基乙二胺）。↓将上述溶液缓慢注入制胶玻璃片至梳齿下1cm,操作中注意防止产生气泡，聚胶30分钟后用ddH2O完全洗净封闭液。↓3.制胶第8页，共48页，2023年，2月20日，星期一制胶所用仪器第9页，共48页，2023年，2月20日，星期一按下列配方配制5％的聚集胶：将表中的前四项组分混匀后，再加入APS和TEMED。↓注入聚集胶前，用滤纸吸干分离胶上的水。缓慢注入聚集胶，过程中注意防止产生气泡。插入梳齿，聚胶30分钟后小心拔除梳齿。↓用ddH2O清洗梳孔，放入电泳槽备用。第10页，共48页，2023年，2月20日，星期一用SampleBuffer按1：1稀释样品↓95℃加热变性5分钟5.上样及电泳将电泳槽内注满1×电泳缓冲液，彻底除去点样孔中和胶底的气泡。↓两边空白的泳道点上等量的SampleBuffer，上样量（20µl含40µg蛋白）↓向电泳外槽内注入1×电泳缓冲液，盖上盖子，电泳开始时电压为80V，染料进入分离胶后，将电压增加到120V，稳压，当染料抵达分离胶底部约80分钟，断开电源4.样品处理

第11页，共48页，2023年，2月20日，星期一上样示意图以及注意事项第12页，共48页，2023年，2月20日，星期一剪6块滤纸和一块NC膜，其大小与胶相同↓将滤纸预先在转移缓冲液中浸泡5分钟，除去气泡↓凝胶电泳完成后取出。按照海绵→3块滤纸→凝胶→NC膜→另外3块滤纸→海绵的顺序依次放，应避免气泡↓用塑料支架夹紧上述各层，放入转移内槽及外槽，注入冰预冷的转移缓冲液。注意NC膜一侧靠正极，胶一侧靠负极↓转移200mA稳流，4℃，1.5小时（时间根据蛋白质的相对分子质量而定）6.转膜第13页，共48页，2023年，2月20日，星期一转移完成后，取出膜放在滤纸上，用铅笔标好正面，室温干燥数分钟↓用westernblotting封闭液封闭NC膜，室温下振荡1小时后4℃过夜（NC膜正面向上）8.一抗结合一抗用封闭液配制（按1：20（CYP1A1）及1:200(β-actin)配制）↓室温振摇2小时（NC膜正面向上）↓以TBS-T洗膜3次，每次5-10分钟注意事项，一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。7.封闭NC膜第14页，共48页，2023年，2月20日，星期一二抗以TBS-T稀释（按1：600配制）↓室温振摇孵育1.5小时（NC膜正面向上）↓以TBS-T洗膜3次，每次5-10分钟10.显色：辣根过氧化物酶显色(1)在试管中先加入1ml×HRP反应缓冲液，然后依次加入试剂A500µl、试剂B500µl、C500µl混匀即可。(2)配制好的溶液应避光存放，30min内使用，染色为褐色。(3)室温下染色时间为5～30min，可根据颜色变化掌握染色时间。(4)等目的条带显色后，用少量PBS清洗。注意事项，显色液必须新鲜配置使用11.照相保存（另有化学发光，显影，定影凝胶图像分析等处理方法）9.二抗结合第15页，共48页，2023年，2月20日，星期一蛋白质双向电泳的原理第16页，共48页，2023年，2月20日，星期一蛋白质双向电泳

是等电聚焦电泳和SDS（聚丙烯酰氨凝胶电泳）的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。第17页，共48页，2023年，2月20日，星期一

等电聚焦电泳

等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展。等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。

这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.第18页，共48页，2023年，2月20日，星期一等电聚焦电泳原理蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。第19页，共48页，2023年，2月20日，星期一

等电聚焦（IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质，从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。等电聚焦电泳原理第20页，共48页，2023年，2月20日，星期一

聚丙烯酰氨凝胶电泳

作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。第21页，共48页，2023年，2月20日，星期一蛋白质双向电泳的方法第22页，共48页，2023年，2月20日，星期一2D/MS经典工作流程细胞裂解匀浆除杂质浓缩定量差异分析双向电泳第一向第二向图像获取图谱分析银染

考染荧光

蛋白标记样品制备分离染色图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞第23页，共48页，2023年，2月20日，星期一样品制备细胞破碎蛋白沉淀溶解抑制蛋白酶活性去除 核酸 脂类 盐，缓冲液，离子性小分子 不溶性物质第24页，共48页，2023年，2月20日，星期一2D/MS经典工作流程差异分析图像获取图谱分析银染

考染荧光蛋白标记染色图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞Separation双向电泳第一向第二向细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备第25页，共48页，2023年，2月20日，星期一蛋白质双向电泳：传统方法sample胶在SDS缓冲液中平衡PrincipleaccordingtoP.H.O’FarrellandJ.Klose(1975)pH10pH10pH3pH3垂直胶管中进行等电聚焦urea,NP-40一向:二向:SDS丙烯酰胺凝胶电泳非连续梯度胶按等电点分离（电荷）按分子量分离（质量）第26页，共48页，2023年，2月20日，星期一使用载体两性电解质IEF时存在的问题不同批次载体两性电解质的重现性载体两性电解质梯度不稳定蛋白载量有限重现性差导致梯度漂移梯度漂移导致酸性和碱性蛋白质丢失管胶柔软，尺寸不定操作者个人技术影响结果第27页，共48页，2023年，2月20日，星期一固相凝胶(支持膜上0.5mm厚凝胶)丙烯酰胺缓冲液:Immobiline®

CH2=CH-CO-NH-R,R：羧基或叔胺基固相pH梯度(IPG)第28页，共48页，2023年，2月20日，星期一Immobiline™

干胶条的特性可重复性无梯度漂移,真正的平衡方法可分离酸性和碱性蛋白容纳蛋白样本量更多水平和垂直SDS凝胶中都能使用允许样本水化上样机械强度和尺寸稳定易操作易于对样本跟踪标记第29页，共48页，2023年，2月20日，星期一新pH范围的Immobiline干胶条高分辨率的IPG胶条，联合使用DeStreak试剂,能改善极碱性区域蛋白点结果 。归功于独特的试剂。 使用pH范围相互重叠的干胶条，可提高2-D图谱分析效率!新pH范围:Immobiline™DryStrippH3–5.6NLImmobilineDryStrippH5.3–6.5ImmobilineDryStrippH6.2–7.5ImmobilineDryStrippH7–11NLImmobilineDryStrippH3–11NL第30页，共48页，2023年，2月20日，星期一不同pH范围胶条不同长度、多种窄pH范围胶条可选，尤其是1个pH范围pH7-11NL碱性胶条第31页，共48页，2023年，2月20日，星期一宽pH、窄pH范围胶条宽pH梯度胶条应用: 整个蛋白图谱窄pH梯度胶条应用: 提高分辨率 增加样品上样量 检测分析更多蛋白pH345678910456789第32页，共48页，2023年，2月20日，星期一提高分辨率:斑点显现IPG4-7IPG5-6IPG4-7IPG5.5-6.7MouseliverproteinsFromA.Görgetal.(1999)第33页，共48页，2023年，2月20日，星期一不同长度的胶条7cm11cm13cm18cm24cm第34页，共48页，2023年，2月20日，星期一2D/MS（蛋白质双向电泳）经典工作流程差异分析图像获取图谱分析蛋白标记图谱分析挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞分离细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备双向电泳第一向第二向银染

考染荧光染色第35页，共48页，2023年，2月20日，星期一Coomassie™Blue-考马斯亮蓝染色+灵敏度，低至0.01mg(“胶体”考染)+非特异性染色+染料与蛋白成比例结合+线性化好扩散速度受限，胶的厚度影响跑胶速度纯度不够有限的动力学范围第36页，共48页，2023年，2月20日，星期一胶体考马斯亮蓝染色1mgE.colistrainBColloidalCBB

G250staining第37页，共48页，2023年，2月20日，星期一银染+灵敏度，低至0.2ng+在凝胶基质中与蛋白交联+自动催化反应线性化程度比考染低步骤多，某些步骤时间控制严格第38页，共48页，2023年，2月20日，星期一SilverstainedgelofE.coliLysate

IPG4-7SilverstainedwithPlusOne™KitwithoutglutaraldehydeandformaldehydeintheAgsol.第39页，共48页，2023年，2月20日，星期一2D/MS经典工作流程差异分析蛋白标记挖点酶解点靶蛋白鉴定体液植物微生物组织细胞分离细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量样品制备双向电泳第一向第二向图像获取图谱分析银染

考染荧光染色图谱分析第40页，共48页，2023年，2月20日，星期一ImageScannerIII图像扫描系统灰度校正功能平台具有防水功能，可直接扫描SDS湿胶。3.7OD高动态范围，保证高、低丰度蛋白的准确定量。扫描平台大，A3扫描面积，一次可扫描2块24cm凝胶。Gray256scaleTransmissive300dpi第41页，共48页，2023年，2月20日，星期一由SIB,GeneBio和GEHealthcare合作开发，为SwissProt推荐分析软件。高效能参数自动找点，全自动蛋白定量计算方法，不受背景影响。在原始数据上进行分析，结果可靠。界面窗口可随意设计，界面极其友好。全自动凝胶匹配，采用先进的算法。根据点的相关因素、形状、位置、周围情况， 胶间匹配效率高。多种统计学分析工具，快速找到胶间蛋白表达差异。可直接链接到ExPASy®和SwissProt®数据库，进行网上检索。全部操作过程都可以撤销/重作操作，每一步骤都附有说明，使用方便。全面支持DIGE技术，源自DeCyd