比色法测定食品蛋白质含量

比色法测定食品蛋白质含量第1页/共11页Ⅲ.比色法测定食品蛋白质含量一、方法的特点与凯氏定氮法相比，用比色法测定生物材料中的蛋白质的含量，具有测定周期短、方便快捷的特点。此类方法是目前蛋白质含量测定的发展的必然趋势，但其测定结果的准确性和重现性比凯氏法要差些。此外，本方法因对蛋白质在溶解性的要求而使其不具有通用性（“见方法的基本要求”）。第2页/共11页二、测定的依据和方法的种类（一）方法的基本原理和依据从生物遗传学角度看，同源蛋白质具有相同比例（或份额）的特征性基团，它们包括构成肽链的酰氨键、非α-氨基（碱性基团）、非末端竣基（酸性基团）和芳香族氨基酸等。随着蛋白质的含量的增加，其特征性基团的表现能力也随之呈现正相关的变化。因此，可以用通过凯氏定氮法已测定蛋白质含量的食品为标准样（称之与待测样具有同源蛋白质的标样），在其适合的条件下测定吸光度并制备标准吸收曲线。在相同条件下测同源的待测样品的光密度，然后从标准吸收曲线上查蛋白质的含量。第3页/共11页（二）方法的种类比色法包括：双缩脲法紫外分光光度法色素结合法第4页/共11页（三）比色法的基本要求由于是用比色法测定蛋白质的含量，而比色法的测定液必须是真溶液，故要求采用此类方法的样品，其蛋白质是可溶的（对测试时使用的溶剂而言）。在一般情况下，蛋白质的溶解是速度是比较低的，所以在进行样品预处理时应做剧烈振荡，从而使蛋白质充分地溶液于溶剂中。要求用与待测样品具有同源蛋白质的标准制作标准曲线！！第5页/共11页三、各论（一）双缩脲比色法双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故能呈此反应。可以把此反应看作是蛋白质所特有反应。本方法是测定蛋白质浓度常用的方法之一，操作简便迅速。但此法灵敏度较差。本方法可用于牛乳、豆类、油料、谷类种子制品（如小麦粉）蛋白质的含量测定。对于其它种类食品，应用范围较小。第6页/共11页三、各论（二）色素结合法在蛋白质的侧链中，有许多酸性基团或碱性基团，它们可以使蛋白质的溶液呈现碱性或酸性；而且，它们还有吸附碱性色素或酸性色素能力，并与对应的色素生成“蛋白质－色素”的沉淀。据此，可用色素结合法对蛋白质用比色法作定量分析。此法是近年来发展比较快的蛋白质定量分析方法，在日本用于色素结合法的染料（色素）已用50余种。有的色素与蛋白质生成可溶性有色“色素－蛋白质结合物，如考马斯亮蓝G-250色素结合法。第7页/共11页三、各论

（三）紫外分光光度法紫外线吸收光谱法是直接测定芳香族氨基酸对红外线吸收光谱（酪氨酸和色氨酸的最大吸收峰为280纳米）及肽键对红外线吸收光谱（肽键的最大吸收峰为190纳米）来测定蛋白质含量的一种方法。［应用］可用于测定牛乳、小麦面粉、豆类、蛋黄及肉制品中的蛋白质含量。第8页/共11页三、紫外分光光度法［牛乳实例］1．试剂95～97%醋酸溶液。2．样品测定操作准确吸取牛乳0.3ml置于25ml比色管中，以95～97%醋酸溶液定容。摇动1分钟，于280纳米处测定其光密度。3．标准曲线的制备准确吸取（已用凯氏定氮法测得蛋白质含量的）标准牛乳0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml分别置于25ml比色管中，以97%醋酸溶液定容，其余同样品测定操作。以标准样的加入量为横坐标、对应的光密度为纵坐标绘制曲线。第9页/共11页四、关于同源样品某种牛奶其单位重量的蛋白质有芳香族氨基酸10个，含有1%蛋白质的奶液对其特征性的紫外光的吸收强度为0.2。那么，含有X%蛋白质的奶液对特征性的UV的吸收强度为：AX牛

=K牛C牛=0.2X某种羊奶其单位重量的蛋白质有芳香族氨基酸20个，含有1%蛋白质的奶液对其特征性的紫外光的吸收强度为0.4。那么，含有X%蛋白质的奶液对特征性的UV的吸收强度为：AX羊

=K羊C