稳定性同位素示踪法

稳定性同位素示踪法第1页，共43页，2023年，2月20日，星期一5.1947年9月在美国Wisconsin大学召开了“同位素在生物学和医学中应用”专题讨论会，从此开始了稳定性核素示踪技术应用的新纪元。6.近20年，稳定性核素示踪技术迅速发展，分离分析方法取得了较大突破，13C、2H、18O、15N广泛应用于生物学、医学、环保、农药、农学、微生物等研究领域。我国先后分离了25种元素的100多种稳定性核素，例如：15N标记化合物就有30余种。第2页，共43页，2023年，2月20日，星期一

几个概念

稳定性同位素（Stableisotope）

丰度（Abundance）

A

即某核在该组同位素中浓度(通常指人工加浓了的)。

自然丰度（Naturalabundaa）A自(AO)15N：0.365%、18O:0.204%

原子百分超（Atompercentexcess）

a

a=A-A自

又称富集度（Enrichment）富集15N（Enriched15N）贫化15N（Depeled15N)第3页，共43页，2023年，2月20日，星期一

一.稳定性同位素示踪法的基本依据：

1.自然界中一种元素同位素组成是相对恒定

2.同一元素的同位素具有相同的化学性质

3.同一元素的同位素之间存在质量差异第4页，共43页，2023年，2月20日，星期一

重要化学元素的稳定性同位素元素同位素自然丰度样品来源H1H99.985新鲜的表面淡水

2H(D)0.0147B10B18.46意大利天然硼酸盐

11B81.54C12C98.892捷克扑利兹石灰石

13C1.108N14N99.635

大气中的氮气

15N0.365O16O99.759大气中的氧气

17O0.037418O0.2039第5页，共43页，2023年，2月20日，星期一

氮的同位素表同位素射线种类半衰期自然丰度12Nβ+0.011S13Nβ+9.96m14N--99.63515N--0.36516Nβ-7.1S17Nβ-4.15S18Nβ-

0.63S第6页，共43页，2023年，2月20日，星期一

稳定性同位素标记物的命名

1978年国际纯化学和化学联合会IUPAC的命名法:结构式:

15[N]HCl或15NHCl（这样純的物质不存在)单标记化合物:H215N-CO-NH2

15N-尿素，例如15N的丰度可为5%，10%，15%……双标记化合物(一个同位素):H215N-CO-15NH2尿素4.

混合标记化合物:(15NH2)13CO(13C15N)尿素第7页，共43页，2023年，2月20日，星期一核素A（%）质量数

14N99.63514

15N0.36515注意：由于同位素之间的质量差异，因此它们的物理、化学、生物化学等性质会有所不同，进行实验时，需注意同位素效应。第8页，共43页，2023年，2月20日，星期一

二.稳定性同位素示踪法的特点：1.无放射性，无辐射效应及不良影响。2.安全、对人无伤害。3.无污染，不受环境条件限制。4.无衰变，实验时间不受限制。5.可进行放射性示踪法难以进行的实验。例：N素中T最长的13N：T=9.096m第9页，共43页，2023年，2月20日，星期一一

三.稳定性同位素分析法的基本流程同位素引入生物体

动植物原始样品仪器所需的待测样品

进样过程

质谱分析法光谱分析法

记录

实验结果分析第10页，共43页，2023年，2月20日，星期一

四.影响15N引入丰度的因素

1.实验材料对15N的稀释程度。

2.N素在不同部位分布的不均匀性

3.分析测定技术所能达到的精度。第11页，共43页，2023年，2月20日，星期一15N示踪法引入N素肥料的丰度计算

参考公式

af=Wp•Rp•ap/Nf•RN式中：af：N素肥料的原子百分超

Wp：植物总重量（待测）

ap：植物样品中原子百分超

Rp：植物样品中含N百分率

Nf：施纯N量

RN：N肥利用率第12页，共43页，2023年，2月20日，星期一

注意事项：1.同位素交换反应：在一定条件下，标记的铵盐可与大气发生反应：

15NH+4水溶液+14NH3→14NH+4水溶液+15NH315N丰度高时应注意。2.同位素效应：藻类对14C、13C、12C的吸收依次递减。3.予测样品测定项目……第13页，共43页，2023年，2月20日，星期一

五、质谱和光谱测定15N原理

14N和15质量不同质谱：把N2离子化为28N-N2，29N-N2，30N-N2

使其在均匀磁场中发生不同角度偏转2光谱：28N-N2：谱线波长为2976.8埃

29N-N2：谱线波长为2982.9埃

30N-N2：谱线波长为2988.6埃-第14页，共43页，2023年，2月20日，星期一入口出口加速电压1800的均匀磁场第15页，共43页，2023年，2月20日，星期一第16页，共43页，2023年，2月20日，星期一

六.供仪器待测样品的制备、测量

1.对待测样品的要求：

(1)因为测量的是不同质量离子流的相对含量，因此，保证有一定的N量即可。一般要求含N量1mg/ml最少不低于0.5mg。

(2)仪器的本底检查。

(3)离子峰的选择（14N和15N的峰比28N、29N小10倍，选28N、29N、30N）。

(4)仪器精确度检查（检查去O2后的空气或纯N气）。第17页，共43页，2023年，2月20日，星期一2.分析样品的制备：

(1)K氏法（Kjeidali）质谱分析常用法。

第18页，共43页，2023年，2月20日，星期一

A.样品的消化：（例：0.05g植样+10ml浓H2S04+3.3gSe:CuSO4:K2SO4为1:10:100混合催化剂→样液清亮再消煮5h（土）或2h(植)，温度120-140℃。样品予处理：水杨酸—硫酸法：5g干土或0.5g植样+12ml水杨酸：硫酸为50g：1000ml溶液中放置30min，再加2.5g硫代硫酸钠和15ml水，缓缓加热至停出起泡→冷却→常规消化）。第19页，共43页，2023年，2月20日，星期一

B.蒸馏：

用蒸汽蒸馏将消化液中NH3分离出来，并测定总N。方法：消化液中加过量40%NaOH,释放的NH3被蒸汽逐出，经冷凝后被2%硼酸吸收，加入混合指示剂用标准硫酸滴定（设置一个标准液）。此步骤将NH3-N转变成了NH4+-N（铵态N），仪器分析适宜量1mgN/样品2-3ml(浓缩或稀释)。(制备好的样品送交仪器分析)第20页，共43页，2023年，2月20日，星期一

以下在质谱仪上进行C.将NH4+-N转化为N2气:

在真空条件下，将上述样品与次溴酸钠反应，放出N气（在质谱仪内进行）详见书15N章节。第21页，共43页，2023年，2月20日，星期一

制样时注意：1.所有试剂纯度要高。2.消化要完全。3.防止样品间交叉污染（每个样品蒸馏前用蒸馏15ml乙醇洗器皿）。4.“Y”型管及内部反应抽气须彻底，防其它气体干扰。

第22页，共43页，2023年，2月20日，星期一以下在光谱仪上进行,可用液体样品也可用干样品(2).杜马法（Dumas）

—光谱分析中常用法适用于含N量低（少于100μg）的样品，光谱测量。

第23页，共43页，2023年，2月20日，星期一第24页，共43页，2023年，2月20日，星期一

方法：A．在放电管中装入样品，氧化剂（CuO）及吸收剂（CaO）抽真空，抽完后熔封放电管。在马福炉中燃烧0.5-3h（560℃）样品，（CaO吸收CO2和H2O)以产生N2气。B．冷却至室温后在光谱仪上测定纯样品火焰为粉红色或淡黄色有CO2呈白色，有水呈黄色）第25页，共43页，2023年，2月20日，星期一

注意：

如果是液体样品。需用Pyrex玻璃管（1cmΦ2mm）吸满样液，烘干后再放入放电管。

CuO、CaO使用前用700℃高温烘干除去CO2，H2O，并在12-18Kg/cm2压力下制成棒状,备光谱分析第26页，共43页，2023年，2月20日，星期一

仪器分析方法步骤：1、通电予热仪器10分钟，打开光电倍增管高压。2、放电管装入燃烧室固定架上。3、开高频发生器电源，使放电管中样品放电发光。4、选择适宜放大倍数对28N、29N、30N峰分别进行放大，在2970A0-2990A0之间扫描。5、放下记录笔，接通扫描开关，划出28N、29N、30N峰高。6、求得平均峰高，计算15N丰度。第27页，共43页，2023年，2月20日，星期一第28页，共43页，2023年，2月20日，星期一

七．15N实验结果计算

14、15的质量比28、29、30的小10倍，不参加运算

当15N丰度小于5%:

R=质量为28离子流强度/质量为29离子流强度此时30N的流子离强度很小，

1.丰度：A=1/2R+1×100%(1)第29页，共43页，2023年，2月20日，星期一

当15N丰度大于5%

R’=质量为29离子流强度/质量为30离子流强度

A=2/R’+2×100%或者由质量为28、29、30的峰值直接算出：A=[29]+2[30]/2（[28]+[29]+[30])×100%

第30页，共43页，2023年，2月20日，星期一以下以植物材料实验为例进行计算，其计算原理也适用于动物等，共同的条件是在一个相对封闭系统内开展实验。（若是用32P等实验，计算时把原子百分超换成比强度即可）

2.植样的原子百分超:ap

ap

=A-A自（2）（A自=0.365%或空白实验值）第31页，共43页，2023年，2月20日，星期一

3.植物从肥料中摄取N的%:Ndff

植物中N有多少%是来自于肥料（Percentageofintheplantderivedfromthefertilizer），可以是根、茎、叶、果实的任一Ndff

Ndff=ap/af×100%（设N素来源于土壤和肥料二方面）（3）af：肥料N的原子百分超（或动物饲料N的原子百分超，此时又多了一个动物排泄因素）。

第32页，共43页，2023年，2月20日，星期一上片解释见第五章第37片同位素稀释法第33页，共43页，2023年，2月20日，星期一4、植物从土壤中摄取N的%（Percentageofintheplanttissuederivedfromthesoil）:Ndfs

Ndfs

=1-Ndff(4)5、植物中来自肥料的N量:Npf

Npf=植物总N量×ap/af

（5）

Npf+Nps=植物中总N量（已在定N中测定,K氏定N法）設总N来源于土壤和肥料，则：第34页，共43页，2023年，2月20日，星期一

6.植物中来自土壤N的量：Nps

Nps=总N-Npf(6)

7.N素利用率：R=Npf/Nf×100%(7)Nf：施入纯N的总量

8.土壤A值：A值

=Ndfs/Ndff×Nf

(Kg/公顷)（8）

A值：表示土壤有效供应N素量(用A值可以解释为什么某种土壤适合于种植某种植物)。

(来自：A值/Ndfs=Nf/Ndff)

第35页，共43页，2023年，2月20日，星期一

9、N素回收率：

R回

=已检出的Nf量/Nf×100%(9)10、N素损失率：

R失

=100%-R回(10)以上公式适用32P等放射性物质（以比强为单位）等计算。

第36页，共43页，2023年，2月20日，星期一练习题：

蕃茄实验地中施用15N-尿素纯N20Kg/亩，收获后测得植物含N量为30Kg/亩，植物样品的15N丰度为0.67%，15N-尿素的15N丰度为1.37%，设自然丰度为0.37%，尿素的含N量为40%。求：1、每亩施入尿素量？2、肥料N素的利用率？3.A值?

解：∵ap=0.67-0.37=0.3%af=1.37-0.37=1.0%∴Ndff=ap/af=0.3/1.0=30%Npf=Np×Ndff=30Kg/亩×30%=9Kg/亩施入尿素量：W=20/40%=80Kg/亩肥料N素利用率：R=Npf/Nf=9/20=45%A值=Ndfs/Ndff×Nf=70%/30%×20Kg/亩=46.7Kg/亩（土壤中可供蕃茄生长的每亩有效N--当然不是全部被吸收,A值愈大说明土壤的供N能力愈强）第37页，共43页，2023年，2月20日，星期一下列研究方法：1.测根瘤数目和干物质产量。早、有无？2.氮素平衡法。十分烦琐。3.比较固N作物和非固N作物总N量差异。4.乙炔还原法。简单、灵敏。5.乙炔还原成乙烯，存在转换因子（3个）。

15N示踪与生物固氮(以下各方法简讲)工业固氮（Haber-Bosch反应）：N2+3H2催化剂/45℃，200在气压2NH3生物固氮：N2+6H++xATP6e-/固氮酶2NH3+xADP+xPi第38页，共43页，2023年，2月20日，星期一

6.同位素法：①15N2还原法（Burris,1941）:充15N2密室进行

NdfA=a样/a气×100%

固氮量=NdfA×总N量②同位素稀释法（J、O、Legg等，1975），15N施入土壤

NdfA=1-a固/a非③AN值法（M、Fried等，1975），田间种固N、非固NNdfA=(As+Afix-As)×NdfF/AfAs、Af、Afix分别代表土壤、肥料、大豆有效N量。

NdfF:来自肥料N素的比例。第39页，共43页，2023年，