核酸理化性质和研究方法

核酸理化性质和研究方法第1页/共48页

课程测验1.胸腺嘧啶除了在DNA中出现外，还出现在____(13年34题):A.tRNA;B.mRNA;C.5SrRNA;D.18SrRNA.2.与氨基酸结合的tRNA部位是____(12年36题):A.3’末端;B.5’末端;C.N-末端;D.C-末端.3.下列核苷中，在真核生物tRNA和mRNA中都存在的是____(12年24题):A.胸腺嘧啶核苷;B.腺嘌呤核苷;C.二氢尿嘧啶核苷;D.假尿嘧啶核苷.第2页/共48页

课程测验4.一段双链DNA包含1000个碱基对，其组成中G+C=58%，那么该双链DNA中T的含量是____(10年25题):A.58%;B.42%;C.29%;D.21%.5.下列DNA模型中，属于左手螺旋的是____(09年24题):A.Z-DNA;B.C-DNA;C.B-DNA;D.A-DNA.第3页/共48页2016年10月6日，2014年诺贝尔奖生理学或医学奖揭晓，拥有美英双重国籍的科学家约翰·奥基夫、挪威科学家梅—布里特·莫泽和爱德华·莫泽夫妇共获殊荣，以表彰他们对大脑“定位系统”的重大发现。2014诺贝尔生理学或医学奖第4页/共48页第十三章核酸的理化性质与研究方法一、核酸的理化性质二、核酸的水解三、核酸的紫外吸收四、核酸的变性复性与分子杂交五、核酸的分离纯化六、核酸一级结构测定第5页/共48页2015年农学门类联考考试大纲考点(一)核酸的种类和组成单位(二)核酸的分子结构1．DNA的分子结构：DNA的一级结构、二级结构、三级结构2．RNA的分子结构：tRNA的结构、mRNA的结构、rRNA的结构(三)核酸的理化性质1．核酸的一般性质2．核酸的紫外吸收特征3．核酸的变性及复性(四)核酸的分离纯化第6页/共48页DNA纯品为白色类似石棉样的纤维状物，RNA纯品则呈白色粉末或结晶。溶解度：DNA和RNA微溶于水，不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机溶剂；在分离核酸时，加入乙醇即可将其从溶液中沉淀出来。DNA和RNA的钠盐更易溶于水，如RNA钠盐在水中的溶解度为4％，分子量在106以上的DNA在水中的溶解度达1％以上时，成具粘性的胶体溶液DNA和RNA在中性或弱碱性溶液中较稳定。一、核酸的理化性质第7页/共48页二、核酸的水解第8页/共48页碱基：嘌呤碱第9页/共48页嘧啶碱第10页/共48页二、核酸的水解1、酸水解糖苷键比磷酸酯键更易水解，特别是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键很容易水解。2、碱水解通常用于RNA水解，DNA的碱水解比较困难。第11页/共48页第12页/共48页二、核酸的水解3、酶促水解◆酶的分类：底物

（DNase/RNase）◆作用方式:外切酶/内切酶◆键的打开方式：3’--OH

5’--OH第13页/共48页核酸外切酶(exonuclease)5’-核苷3’-核苷第14页/共48页第15页/共48页核酸内切酶(endonuclease)第16页/共48页■核酸限制性内切酶

一类专一识别特殊核苷酸序列水解双链DNA的内切酶。

主要由细菌产生，如E.coli;

专一性极强高度特异的识别位点，这些位点通常在4至8个碱基对范围，且往往为回文结构;

切割后产生所谓粘性末端或平末端。第17页/共48页EcoRⅠ切割位点：—N-C-T-T-A-A-G-N-5’5’-N-G-A-A-T-T-C-N—↓↑第18页/共48页第19页/共48页

EcoRI5‘GAATTC3’5’GAATTC3’3’CTTAAG5’3’CTTAAG5’5‘GGCC3’5’GGCC3’3’CCGG5’3’CCGG5’

HaeIII

限制性内切酶是分子生物学研究的重要“工具酶”！第20页/共48页

三、核酸的紫外吸收第21页/共48页三、核酸的紫外吸收紫外法测定核酸含量的理论基础(260nm)

A260/A280=1.8:纯DNAA260/A280=2.0:纯RNA第22页/共48页四、核酸的变性复性与分子杂交核酸的变性(Denaturation)：指核酸的双螺旋结构中的氢键断裂，成为两条单链的过程。核酸变性不涉及共价键(磷酸二酯键)的断裂，而核酸链的磷酸二酯键断裂称为核酸的降解。引起变性的因素:如加热、环境体系氢离子浓度变化、脲素、胍等。变性的核酸生物活性丧失。第23页/共48页DNA变性第24页/共48页

增色效应：

变性后的核酸，由于嘌呤碱基和嘧啶碱基的充分暴露，在260nm处的光吸收能力明显增加，此现象称增色效应。常用的使DNA变性的方法是加热。

Tm值：通常把增色效应达到一半时的温度或DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔解温度或解链温度，用Tm表示。第25页/共48页

Tm=69.3+0.41〔%﹙G+C﹚〕第26页/共48页DNA的复性（renaturation）

复性:变性DNA在适当的条件下,彼此分开的两条链重新缔合成为双螺旋的过程.

退火:热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，冷却的过程叫退火.

复性后的DNA发生减色效应，生物活性恢复。第27页/共48页1、DNA的片段越大,复性的速度越慢;2、DNA的浓度越高,复性的速度越快;3、DNA的重复序列越多,复性的速度越快;4、溶液的pH过高或过低,复性的速度均会降低;5、适当增高溶液的离子强度,复性的速度会增高。影响复性速度的因素：第28页/共48页核酸的分子杂交第29页/共48页核酸的分子杂交两条来源不同但有互补关系的DNA单链,或DNA单链与RNA分子,在去掉变性条件后互补的区段能够退火形成双链DNA分子或DNA/RNA异质双链的过程称为分子杂交.第30页/共48页Southern杂交：样品DNA用限制性内切酶切割成一定大小的片段，进行变性凝胶电泳，将凝胶电泳形成的DNA区带转移到膜上再进行杂交，这种技术称作~。Northern杂交：将RNA凝胶电泳形成的区带转移到膜上再进行杂交称作~。Western印迹：将蛋白质凝胶电泳形成的区带转移到膜上再与酶标抗体进行特异反应称为~。Eastern印迹：将蛋白质等点聚焦形成的区带转移到膜上再与酶标抗体进行特异反应称作~。核酸的分子杂交第31页/共48页第32页/共48页五、核酸的分离纯化策略：DNA的分离提取：防止剪切RNA的分离提取：防止酶解方法：超速离心、柱层析、凝胶电泳第33页/共48页第34页/共48页第35页/共48页核酸的分离、提纯和定量测定1

DNA的分离用1mol/L的NaCl制备组织匀浆,离心除去组织残渣,多次用苯酚处理使蛋白质变性,每次处理后离心取上层水相,最后加2倍体积的乙醇沉淀出DNA。2

RNA的分离由于RNA酶存在广泛,且十分稳定,破碎细胞时要加入胍盐破坏RNA酶,试剂要用0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯）配制,器皿要高压灭菌或用0.1%的DEPC处理,多次用苯酚或氯仿处理使蛋白质变性,每次处理后离心取上层水相,mRNA可用寡聚dT-纤维素亲和层析从总RNA中分离。3核酸含量的测定法常用的方法是测定260nm的消光度,用公式计算核酸的含量。核酸的含量也可以用定磷法测定。

DNA的含量可以用二苯胺显色法测定。

RNA的含量可以用地衣酚显色法测定。第36页/共48页4、核酸的超速离心超速离心可以分离超螺旋DNA（密度大）,线性DNA（密度小）和闭环DNA（密度居中）。也可以分离RNA。5、核酸的凝胶电泳松弛型，OC,OpencircularDNA超螺旋,CCC,covalently-closedcircularDNA从细菌抽提得到的质粒DNA样品中不含线状DNA第37页/共48页六、核酸一级结构序列测定1、DNA的化学法测序2、DNA的酶法(末端终止法)测序

第38页/共48页1、DNA的化学法测序第39页/共48页2、DNA的酶法(末端终止法)测序

一代测序第40页/共48页第41页/共48页人类基因组计划1990年启动、2000年完成，中国于1999年9月积极参加到这项研究计划中的，承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约3000万个碱基对的测序任务。第42页/共48页DNA测序新进展二代测序：大规模平行测序

454测序

、Illumina测序三代测序：高通量、单分子测序

纳米孔单分子，不需要进行PCR扩增

第43页/共48页本章小结1.名词：核酸内切酶、核酸外切酶、限制性内切酶、增色效益、减色效益、变性、复性、Tm值、退火、分子杂交2.核酸紫外吸收特点3.核酸的变性、复性与杂交4.核酸分离方法第44页/共48页

课程测验1.5’末端通常具有帽子结构的RNA分子是____(08年25题):A.原核生物的mRNA;B.原核生物的rRNA;C.真核生物的mRNA;D.真核生物的rRNA.2.真核生物mRNA中5’末端的m7G与第二个核苷酸之间的连接方式是____(09年23题):A.5’2’;B.5’3’;C.3’5’;D.5’5’.第45页/共48页

课程测验3.现有纯化的小牛胸腺DNA和牛血清白蛋白溶液各1瓶。简要写出根据核酸与蛋白质紫外线吸收的特征区分上述两种物质的实验原理(12年40题):【答案要点】