最佳呼吸机设置的生理和病理学基础

最佳呼吸机设置的生理和病理学基础第1页/共42页

为什么必须改变呼吸机设置的理念?第2页/共42页为什么需要肺复张治疗?第3页/共42页死亡率变化趋势第4页/共42页为什么需要改进ALI和ARDS定义?第5页/共42页患者特征（ARDS定义）急性发作在不考虑PEEP水平的情况下PaO2/FiO2<200mmHg胸部正位X线或CT示双侧浸润PAWP<18mmHg或无左房高压的临床证据第6页/共42页2.1患者特点原理：为什么不完全接受ARDS的AECC定义？急性发作胸部正位X线或CT示双侧浸润PAWP<18mmHg或无左房高压的临床证据第7页/共42页第8页/共42页病毒载体非病毒载体引起免疫反应容量小、制备困难无靶向性裸DNA直接注射磷酸钙共沉淀脂质体设备昂贵不适合大量细胞的转染转染率低已很少使用细胞毒性抑制外源基因的表达致DNA失活纳米材料第9页/共42页壳聚糖的研究现状体外转染安全高效大鼠体内实验表明半乳糖基化壳聚糖有肝靶向性大型动物体内基因转导实验尚无文献报道研究背景第10页/共42页三、研究内容研究内容大量提取纯化质粒chitosan纳米微囊体外转染7721细胞GdCl3iv体内注射取主要脏器组织，检测报告基因表达第11页/共42页第一部分研究内容壳聚糖－质粒DNA复合物的制备第12页/共42页

实验方法质粒的酶切鉴定研究内容图2.pEGFP-N1质粒图谱，下方为MCR第13页/共42页研究内容图3.pBIND质粒图谱，右侧为其MCR第14页/共42页研究内容质粒的大量提取与纯化

QiagenTM

Endo-Free

plasmid

GigaKits

无内毒素纯度≥2×氯化铯梯度抽提

第15页/共42页壳聚糖－DNA复合物（纳米微囊）的制备研究内容质粒DNA50mmol/LNa2SO4＋0.02％chitosanVertex(2500rpm)30s第16页/共42页实验结果研究内容12M图4.质粒酶切产物电泳图。1为pBIND，2为pEGFP-N1，M为DNA100bpladderMarker67bp34bp第17页/共42页研究内容M1234图5.纳米微囊及质粒DNA电泳图。M为marker，

1、3分别为pEGFP-N1，pBIND质粒DNA，2、4分别为含pEGFP-N1/pBIND的纳米微囊

第18页/共42页壳聚糖－DNA在7721肝癌细胞中的表达研究内容第二部分第19页/共42页实验方法研究内容细胞培养与细胞爬片制作SMMC-7721细胞0.25％胰酶消化，加1-2滴至12孔板中的盖玻片上，37℃孵箱放置1h，使细胞贴壁第20页/共42页研究内容用壳聚糖－质粒（pEGFP-N1）纳米微囊转染，以脂质体LipofectamineTM2000包裹相同的质粒作为阳性对照转染第21页/共42页检测报告基因表达情况DAPI溶液染色荧光显微镜下观察在同一视野下，分别计数绿色荧光蛋白表达的细胞数和DAPI染色的细胞数，计算转染率研究内容第22页/共42页统计学分析：

所得数据处理用SPSS11.5统计软件进行统计学处理，用两样本均数比较的t检验p＜0.05为差异有统计学意义研究内容第23页/共42页实验结果图6.7721细胞中GFP的表达×200 图7.7721细胞DAPI染色×200研究内容第24页/共42页表1

壳聚糖组和脂质体组的转染率（％）壳聚糖组脂质体组58.354.760.4±2.2*55.6±1.6分组视野2转染率值*p<0.05vs脂质体组

±S研究内容视野3视野162.860.257.554.6第25页/共42页讨论本实验结果提示壳聚糖体外转染的效率略高于转染试剂脂质体，说明壳聚糖是一种有效的体外转染材料,为下一步体内实验打下良好的基础研究内容第26页/共42页壳聚糖肝靶向性基因转导体内实验研究内容第三部分第27页/共42页

实验方法实验动物与分组

研究内容杂种犬6只，第四军医大学实验动物中心随机分为2组实验组注射壳聚糖－质粒纳米微囊对照组仅注射裸质粒第28页/共42页术前准备

研究内容手术前1d静脉注射氯化钆，清除Kupffer细胞

第29页/共42页研究内容图8.动物手术示意图第30页/共42页图9.动物手术图示，A为解剖肝门部，B为注射壳聚糖-DNA复合物研究内容AB第31页/共42页研究内容48h后处死动物，取肝、心、脾、肺、肾组织，作冰冻切片滴少许甘油－碳酸盐缓冲液，放置盖玻片。置于荧光显微镜下，观察绿色荧光蛋白的表达情况第32页/共42页研究内容实验结果图10.肝组织中GFP的表达，可观察到黄绿色荧光×200第33页/共42页A.心B.肺D.脾C.肾图11.其他组织无阳性荧光表达×200

第34页/共42页壳聚糖（chitosan）的优点资源丰富生物可降解性无免疫原性靶向性保护DNA免受DNase的降解研究内容讨论第35页/共42页图12.壳聚糖具有肝靶向性的原理示意图研究内容第36页/共42页关于壳聚糖在大型动物体内的基因转导，国内外尚无文献报道壳聚糖通过纳米微囊表面携带的正电荷与细胞膜上携带负电荷的糖蛋白及磷脂的相互作用引发细胞胞吞作用而进入细胞。而且，壳聚糖能包裹、浓缩DNA，使DNA免受DNase的降解研究内容第37页/共42页经肝动脉和门静脉注射的给药途径，临床上有可行性如果用适当的功能基因替换报告基因,预期相应的基因也可以表达,并可能达到一定的治疗效果

研究内容第38页/共42页小结本实验以壳聚糖与质粒制备成纳米微囊复合体，体外转染7721细胞，结果表明壳聚糖有较高的体外转染效率体内实验通过肝动脉、门静脉联合给药，在肝检测到较高的绿色荧光蛋白表达水平首次在大型动物体内完成壳聚糖介导的外源性基因表达小结第39页/共42页致谢衷心感谢我的导师窦科峰教授在学习生活过程中的照顾和教导感谢陈勇教授在实验过程中