氨基酸分析测定及衍生化方法

本文格式为Word版，下载可任意编辑——氨基酸分析测定及衍生化方法

HPLC的使用之一

氨基酸分析测定及衍生化方法

2

吕莹果1，，张晖2，孟祥勇2，陈能飞3

（1.河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450001；2.江南大学食品学院，XXXX214122；

3.广州江大和风香精香料有限公司，广东广州510660）

HPLC的使用之一

有吸收时，也可同时进行分开和检测；其主要缺点是衍生化条件自由度有所限制。由于衍生反应在特定反应器中进行，常造成色谱峰展宽，使分开度降低；过量试剂或试剂水解产物可能造成干扰；寻常需要特定设备配件。

柱前衍生化，样品组分经特定化学反应，转变为发光或发色衍生物，再进行色谱分开测定。该法有以下优点：寻常不考虑衍生化反应动力学，直到衍生反应完全；为使衍生反应及衍生产率获得最正确效果，可任意选定衍生化条件柱前衍生化反应的溶剂不必与分开时滚动相相匹配；衍生化副产物可进行预处理以降低或消除其干扰。其主要缺点表现为：柱前衍生化反应形成副产物可能对色谱分开造成较大干扰，有时严重影响衍生化反应重复性；衍生物水解、反应溶剂杂质组分造成大量干扰峰〔17〕。

相比之下，柱前衍生法对仪器要求相对更低，且优点更为突出，普适性广，应用更为广泛。3氨基酸柱前衍生化方法

近年来，柱前衍生RP–HPLC分析氨基酸得到迅速发展，RP–HPLC要求将氨基酸在柱前转化为适于反相色谱分开并能被灵敏检测的衍生物。柱前衍生关键在于衍生试剂选择，常用柱前衍生试剂一般需具备以下几个特点〔18~20〕：（1）摩尔吸光系数大；

（2）良好发光或发色性能，与被标示生物基质结合后特性不减弱；

（3）可与被标示物通过物理或化学作用结合，未结合标示剂及其水解产物易于清除或分开；（4）与背景对比明显，以避开杂质干扰，提高检测灵敏度；

（5）标记反应条件温柔，确保被标示生物基质原有化学性质不被破坏；（6）易于合成、保存，无毒；

（7）形成衍生物在乙睛和甲醇中有足够溶解度；（8）衍生产物稳定性强。

根据以上要求，有几种常用柱前衍生化试剂，具体衍生化方法及结果评价如下。3.1荧光胺

荧光胺（Fluorescamine，简称FA），1972年，Uden-Friend〔21〕等发现和茚三酮产物通过氧化脱羧后形成苯乙醛，在过量茚三酮存在下能迅速与氨基酸形成强荧光产物；随后鉴定这一中间体结构并命名为荧光胺，荧光胺与氨基酸反应方程式如图1所示。

PITC可与一级和二级氨基酸同时反应，衍生产物单一、稳定，冻干衍生产物–20℃可贮存30d，4℃水溶液中可贮存3d，色谱响应值无明显变化。但样品制备较为繁琐，需预先去除剩余试剂；且虽严格操作，但存在于样品中痕量PITC试剂也会缩短分析柱寿命。3.3氯甲酸芴甲酯

氯甲酸芴甲酯（9–fluorenylmethylchlorformate，简称FMOC–Cl），寻常状况下，FMOC–Cl与氨基酸反应，生成一种具有强荧光产物FMOC–AA，反应方程式如图3所示。可用荧光检测，激发波长为265nm，发射波长为310nm；

也可用紫外检测。

寻常状况下，一、二级氨基酸、醇、水等都能与荧光胺起反应，但只有一级氨基酸形成荧光衍生物。因此，该试剂具有一定选择性，能与一级氨基酸在pH9和室温条件下瞬时反应，衍生产物具有高荧光强度；而试剂本身则迅速水解成不带荧光产物，不影响分析，是一种理想柱前衍生化试剂。其荧光激发波长390nm，发射波长475nm〔22~23〕。3.2异硫氰酸苯酯

异硫氰酸苯酯（Phenylisothiocyanate，简称PITC），早期主要是作为异硫氰酸甲酯替代物出现〔24〕。随衍生氨基酸技术不断完善，近年来，PITC法已成为普遍用于RP–HPLC分析氨基酸方法之一。室温下，PITC与氨基酸反应生成苯氨基硫甲酞衍生物（PTA–AA），在原有氨基酸结构中引入苯环，使氨基酸极性大大降低，衍生反应可在5~10min内完成，反应方程式如图2所示。由于试剂具有挥发性，所以需用过量试剂进行反应，反应后剩余试剂通过减压蒸馏去除，再进行色谱分开。

HPLC的使用之一

FMOC–Cl能同时与一级和二级氨基酸反应，反应迅速，可在30s内完成；衍生产物需迅速用戊烷萃取，萃取所得化合物稳定，在室温可稳定保存13d。试剂本身及其水解产物（FMOC–OH）有荧光，对色谱分开会产生一定干扰；与组氨酸形成衍生物不稳定，影响定量。

3.46–氨基哇琳基–N–琥珀酰–亚胺基甲酸酯

6–氨基哇琳基–N–琥珀酰–亚胺基甲酸酯（6–aminoquinolyl–N–hydroxy–succinimidylcarbamate，简称AQC），是一种较新柱前衍生试剂，也是近年应用较为广泛氨基酸柱前衍生试剂之一。AQC与氨基酸反应迅速，反应方程式如图4所示。衍生产物既可用紫外检测，检测波长254nm；也可用荧光检测，激发波长250nm，发射波长395nm。

到最大产率。衍生产物荧光易因缓冲液淬灭，衍生产物不太稳定，需在密闭和避光条件下反应，且衍生完成后需马上进样分析，易生成多级衍生物；如组氨酸与Dansyl–Cl反应产物易形成双峰，重复性较差。3.6邻苯二甲醛

邻苯二甲醛（o–phthaldialdelhyde，简称OPA），能在还原剂巯基乙醇存在下与一级氨基酸反应生成具有很强荧光异吲哚衍生产物，反应迅速，在室温下1min即可完成，反应产物激发波长350~360nm，发射波长450nm，具体反应方程式如图6所示。

OPA衍生氨基酸反应特点如下：

优点：OPA本身不发荧光，色谱分开中不会形成干扰峰；OPA与硫醇试剂联用和一级氨基酸反应迅速，易于实现在线自动化。仪器设备简单，普通试验

AQC可同时与一、二级氨基酸反应，试验操作简单、反应时间短；且衍生产物稳定，定量确凿；衍生缓冲液适用范围宽，一般为8.2~9.7；但衍生试剂水解产物影响分开。此外，当样品中存在羟基脯氨酸和羟基赖氨酸时，反应副产物会严重干扰定量〔25~26〕。3.5丹磺酰氯

丹磺酰氯（Dansyl–Cl），也是近年常用氨基酸荧光衍生试剂之一。寻常Dansyl–Cl与氨基酸反应，形成单酞化衍生物具有很强荧光，反应方程式如图5所示。衍生产物激发波长330nm，发射波长550nm，也可用紫外检测，检测波长250nm。

室均可满足要求；衍生产物对柱损耗小。

缺点：OPA不能直接与二级氨基酸（脯氨酸和羟基脯氨酸）反应，需预先在NaClO等氧化剂作用下氧化开环，也可通过与FMOC–Cl联用方法衍生二级氨基酸。OPA与氨基酸衍生产物不稳定，衍生后需马上进样分析；胱氨酸衍生产物产量很低而不能被检出。3.72，4–二硝基氟苯

2，4–二硝基氟苯（2，4–dinitro–fluorobenzene，简称DNFB），在避光、60℃条件下，能与一、二级氨基酸同时反应生成一种稳定衍生产