有功能的人类乙型肝炎病毒聚合酶的提纯与表达

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摘要

目的：排除细胞质的因素，识别一种有效的方法，可以提炼有用的乙型肝炎病毒的聚合酶。

方法:完整的HBV-POL（843个氨基酸）的5’端用多个组氨酸标记，在大肠杆菌体内高水平表达。缓冲液溶解HBV-POL,树脂层析法提纯。大多数重组的HBV-POL被洗提在有NP-40存在的100mmol/l的咪唑溶液中，一种弱的洗涤剂保持HBV-POL的活性。一种还原的药剂应用在HBV-POL的提纯过程中，保护易溶解的HBV-POL免受多余的二硫化物的粘连。

结果:应用大肠杆菌大规模生产完整的HBV-POL。提纯的HBV-POL有稳定的反转录酶和DNA聚合酶的活性。提纯的蛋白高纯度且有反转录酶的活性。

结论：应用纯净的方法大规模生产HBV-POL,便于结晶化，详细研究其结构和机制。这种提纯方法的能力能获得人类HBV-POL的一种酶地活跃形式，有助于研究药物去治疗人类的慢性肝炎。

介绍

HBV感染是全球的公众健康问题，据估算全球有350-400百万人被慢性感染，有很大一部分人最终患了要挟生命的肝的疾病，如肝硬化、肝癌或其他疑难杂症。HBV自我复制通过与翻译

相反的步骤，用聚合酶根据自己的基因组被编码。HBV-POL是个多功能蛋白质，有启动蛋白的活力，以及DNA聚合酶和反转录酶的活性，有RNA-H酶活性，但它是短的校对活性。大多数合格的治疗慢性肝炎的药物都是核苷酸反转录酶的抑制剂，就是把HBV-POL当作靶子。几十年用这种方法治疗效果已经受限，因此急需一种更快更简单更高效的药物去治疗这种病。

HBV-POL这种酶在不同的系统中表达以及对它大量的提纯是困难的。基于这些问题，治疗药物的发展不能取得令人满意的进步，这种酶的生物研究被引领。有一些群体成功的使这种酶在体外表达，并且表达完整，这种表达需要DDDP和RDDP的活性。人类的HBV-POL被表达是在体外的兔子网状细胞系统中进行的，体外表达的这种酶只有DDDP活性，没有RDDP活性。在大肠杆菌中有RDDP活性，它与一种蛋白结合了。有酶活力的HBV-POL在大肠杆菌被获得，但得需要GRP94的一种聚合酶陪伴表达才行。但是这种没有分子伴侣陪伴表达，稳定且大规模的完整HBV-POL被表达出来还没有人报道过。

在这项研究中，HBV-POL携带六个组氨酸在大肠杆菌中被表达。HBV-POL有大约2.5%的半胱氨酸剩余，是一个大分子，因此，这种蛋白被期望能进入体内。基于这个原因，所有的溶解产物被高浓度的SDS溶解。降低剂量进入体内，然后SDS被一种弱的洗涤剂替换在洗的过程中，最终靶蛋白被纯化。纯化的HBV-POL有DDDP和RDDP的活性。这是第一次在大肠杆菌中没有分子伴

侣或者其它助手HBV-POL得以表达。这种酶可能有助于药物发展在治疗CHB中。

原料和方法质粒构造

肝组织来自慢性乙型肝炎的携带者，并有表面抗原，此患者曾做过切除手术。肿瘤组织被解剖，切成小块放在液氮中备用。组织中的DNA被提取。HBV-POL相关的的东西被加强，使用更专一的聚合酶。对于一个完整的的P基因需要：

CPNotIF01:GTTGCGGCCGCATAATGGCCCTATCTTATC

CPBstBIR01:ATTTTCGAATTCTCACGGTGGTTTCCA

大肠杆菌的转化

质粒pTrcHis-A-Pol被化学转变在有决定权的DH5α的细胞中，此细胞由RealBiotech公司供给。IPTG参与到5ml的过夜的大肠杆菌中，最终浓度为1mmol/L，分别孵化4、8、12、16小时,分别保存在18℃,24℃,30℃,37℃和42℃下。离心法获得细胞，在裂解缓冲液中混匀。蛋白质的表达水平由反-Xpress抗体决定。

组氨酸标记的HBV-POL的表达与纯化

被转化的细胞在100mL的LB肉汤中培养，直到培养达到OD6000.6-0.8。添加IPTG使最终浓度为1mmol/L，在18℃下孵化8-10小时，并不断晃动。感应的细胞通过离心法获得，在2000g、20min、4℃条件下.裂解-缓冲液体积与细胞

小粒的比率为4：1.溶菌液在室温下孵化30分钟，超声波降解10×10s。在每一个音波下样本在冰中冷却5-10s。悬浮液在室温下离心30min，20000g。悬浮在表面的物质需要转移到Ni-NTA树脂柱中，参与16ml的平衡缓冲液相平衡（和前面没有加裂解酶的裂解液组分一致）。树脂和浮在表面的溶菌液完全并缓和的混合，室温保存45-60分钟。树脂用8mL的洗涤缓冲液洗6-8次（50mmol/L磷酸盐缓冲液，pH8.0,0.5mmol/LNaCl,1%NP-40，10mmol/L咪唑，20mmol/L2-mercaptoethanol，1×Roche蛋白质抑制剂混合物）。用6mLE-50,E-75,和E-100洗提缓冲液洗提HBV-POL片段（50mmol/L磷酸盐缓冲夜,pH8.0,0.5mmol/LNaCl,1%NP-40,1×Roche蛋白质抑制剂混合物），将DDT加到收集管中使最终浓度为5mmol/L。E-50,E-75,和E-100缓冲液中咪唑的浓度分别为50mmol/L,75mmol/Land100mmol/L,获得小片段洗提的HBV-POL，保存在-70℃。纯化的蛋白样品的浓度由一个BCA测试决定，以牛的血清白蛋白为标准。

Anti-反转录酶多克隆抗体的准备

在全长的聚合酶纯化前需准备RT多克隆抗体（数据不展示）。重组的RT（304-693个氨基酸）由大肠杆菌中提取。五十个微小纯化的RT和Freund’s完全辅佐物注射到小鼠的皮下。另一个50μg纯化的RT和Freund’s在第一次注射后的两周注射。在其次次注射两周后处死小鼠，为了取血清中

的anti-RT多克隆抗体。用ELISA检测抗体滴定量和RT肽的比率，应大于1：32000.

SDS,dotblot和蛋白免疫印记法分析全部的溶菌液和其他的洗提部分在95℃下加压5分钟。蛋白质用SDS法分开。Gels用CoomassieBlue染色。对于botblot分析法，每个样本取1mL滴到硝化纤维膜上，此膜第一步需用稀释的1/4000anti-Xpress抗体和goat-anti-mouse共轭碱性磷酸酶处理。对于蛋白免疫印记分析，蛋白质转移到膜上，第一步需用稀释的1/4000anti-RT和goat-anti-mouse共轭碱性

HVB-POL的体外转录与翻译的表述

重组的质粒pT7-Pol用QiagenMidiprepDNA纯化装备纯化。体外转录与翻译需用连接网状细胞的溶菌液系统TNTT7。两个小质粒DNA模板转录并翻译成蛋白质，无论有没有S标记的甲硫氨酸，在30℃、75分钟的条件下都能发生反应。参与0.1mg/mL环己酰亚胺（用以检验聚合酶活性）或SDS样缓冲液（用以检验翻译效率）后体外翻译就中止了。体外翻译的蛋白质通过4%-12%SDS分开开，在放射自显影之前先枯燥。

DNA聚合酶活性和RT活性检测

DDDP和RT/RDDP的检测可以通过合成DNA，使用poly(dA)?oligo(dT)12-18和poly(rA)?oligo(dT)12-18

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的生产有功能的并且完整的人类HBV-POL是成功的。这种纯净形式的重组蛋白的可利用性，便于HBV-POL的结晶化和结构机制的详细分析，大量的有功能的人类HBV-POL的可利用性有助于高产的筛查检测药物的发展，对于CHB的治疗。

解释

HBV-POL是一个多功能的蛋白质，有内在的RNA依靠的RT，DNA依靠的DNA聚合酶和RNA酶的活性。在不同的系统中，HBV-POL的表达和纯化被大量困难限制。所以在大肠杆菌中表达人类完整的HBV-POL是急需的，并且表达中不能有分子伴侣或者其他物质陪伴。纯化的HBV-POL显示了稳定的RT活性和DNA聚合酶活性。功能性的HBV-POL将有助于潜在的药物发展，去治疗CHB。

研究领域

HBV是一个小的DNA病毒对人类健康有大的要挟，它依据前基因组RNA反转录进行复制。大多数治疗CHB感染被检验过的药物是HBV-POL的核苷酸反转录酶的抑制剂。HBV-POL的分析由于在重组系统中不能表达有功能的酶而受到限制。基于这个原因，我们应用了多种策略在大肠杆菌中大规模的生产有功能的并且完整的HBV-POL。

新观念和新突破

在大肠杆菌中表达人类完整的HBV-POL是急需的，并且表达中不能有分子伴侣或者其他物质陪伴。为了获得高水平

的重组HBV-POL，N-末端标记的6个组氨酸和Xpress抗原决定簇在HBV-POL的N末端融合。其次，靶蛋白最大限度的表达需降低感应温度，一个高浓度的还原剂应用到纯化过程中，保持HBV-POL