探讨了低氧对不同级别PASMCs增生及迁移的影响,病理学论文

探讨了低氧对不同级别PASMCs增生及迁移的影响,病理学论文2．2低氧对3组大鼠PASMCs增生功能的不同影响分别对3组PASMCs进行常氧(DMEM+2%FBS、5%CO2、21%O2、37℃)和低氧(DMEM+2%FBS、5%CO2、3%O2、37℃)干涉48h后，采用MTT法检测细胞活力。常氧条件下，3组PASMCs细胞吸光度值分别为(1．3700．700，1．6610．136，1．5680．144，n=3，P＞0．05)，差异无统计学意义。而在低氧处理后，小肺动脉和中动脉组PASMCs细胞吸光度值分别为2．5040．093和2．7290．038，显着高于大肺动脉组PASMCs的吸光度值1．9530．116，差异均有统计学意义(n=3，P＜0．01，图3A)，讲明低氧情况下，中小动脉肺血管平滑肌细胞具有更强的增生能力。PCNA是增生细胞核抗原，与细胞DNA合成关系密切，在细胞增生的启动中起重要作用，其表示出含量代表细胞的增生能力。Westernblotting的结果也显示出，在常氧条件下，3组PASMCs内PCNA表示出含量灰度值分别为(0．4150．052，0．5510．089，0．3810．108，n=4，P＞0．05)，无明显表示出差异。低氧干涉后，中小肺动脉组PASMCs的PCNA表示出含量明显升高，分别为0．8530．023和0．8850．089，显着高于大肺动脉组PASMCs的PCNA表示出含量(0．5090．028)，差异均有统计学意义(n=4，P＜0．01，图3B)，进一步讲明中小肺动脉平滑肌细胞增生能力高于大肺动脉平滑肌细胞。2．3低氧对3组大鼠PASMCs迁移功能的不同影响选取生长状态良好的同一代PASMCs进行实验，待细胞贴壁后用无血清DMEM培养基饥饿24h使细胞同步化，随后用枪头在培养皿底部作2～3条平行的划痕，根据分组情况给予常氧和低氧干涉48h后，分别对迁移到空白区域的细胞个数进行计数。常氧条件下，3组PASMCs的细胞迁移数量分别为(49．0007．810，68．0007．767，71．0004．041，n=3，P＞0．05)，差异均无统计学意义。而在低氧干涉后，中小肺动脉组的PASMCs迁移到空白区域的细胞个数分别为102．3004．842和141．0009．644，均显着高于大肺动脉组PASMCs的细胞迁移数量62．6705．044，差异均有统计学意义(n=3，P＜0．01，图4)。3讨论肺动脉高压是由多种发病机制引起的以肺动脉收缩加强、中小肺动脉重构为主要病理、生理变化，最终导致肺血管阻力持续性增加、肺动脉压力升高的复杂性疾病。肺动脉的重构主要表现为PASMCs的增生与肥大，管壁变厚，内径变窄等。在临床肺动脉高压的患者以及肺动脉高压的动物模型中，均发现肺血管重构主要发生在末端的小动脉，并且呈逐步进展性，最终导致末端血管的闭塞，提示肺动脉高压发生的主要部位在远端肺动脉，有研究显示，大鼠肺内一级动脉主干直径为600～800m，二级动脉分支直径为400～600m，三级动脉分支直径为100～400m，而四级动脉分支及以上，动脉直径只要不到100m。在低氧28d后，直径小于200m的微小肺动脉已经闭塞消失，在低氧性肺血管收缩实验中，小动脉的收缩及敏感性高于大动脉，血管直径的动脉变化显示，小于500m的中小肺动脉有一个明显的减少经过，而华而不实最显着的变化则发生在直径为200～300m的肺动脉中。但是对于不同级别肺血管反响性不同的细胞与分子机制当前尚不清楚。本研究采用胶原酶消化法原代培养正常大鼠3组PASMCs，获得的PASMCs呈长梭形，培养2～3d后呈簇状或并行排列生长，7～10d后细胞融合呈峰-谷状生长，表现出典型的血管平滑肌细胞形态学特征。平滑肌-SMA蛋白是血管平滑肌表示出的特征蛋白。本实验通过激光共聚焦荧光显微镜免疫荧光染色发现，大鼠3组PASMCs免疫荧光染色呈阳性反响，可见典型的、并行排列的绿色纤维，证实PASMCs表示出平滑肌-SMA蛋白，符合血管平滑肌细胞的免疫学构造特征。PASMCs由收缩型向合成型转换即增生能力加强并从肺动脉中膜迁移至内膜(迁移功能加强)是低氧导致肺血管重构的关键环节。本实验将原代培养PASMCs分别暴露于常氧与低氧环境中，用MTT和Westernblotting的方式方法检测细胞增生情况，用伤口愈合实验检测细胞的迁移能力，发如今低氧条件下中小肺动脉组PASMCs的增生与迁移能力均显着高于大肺动脉组PASMCs，因而3组肺动脉确实在生理条件下已存在某些潜在的差异，使得在低氧时中小肺动脉愈加敏感，促使其更易发生血管重构。以往有研究以为可能与分布在肺的大动脉和小动脉的平滑肌属性的不同和中层平滑肌细胞在肺近端与远端动脉的细胞组成上的不同有关。肺小动脉平滑肌细胞的细胞表型，细胞内骨架蛋白的表示出和离子通道的开放情况与大动脉相比同样存在着显着的差异，这有可能是其具有特殊功能的原因之一。缺氧能够通过抑制K+通道来促进膜的去极化，进而激活L-型Ca2+通道最终使得小肺动脉发生收缩。在低氧条件下，平滑肌细胞内K+通道的表示出与功能不同，影响蛋白表示出的转录因子也不同。本研究尚存在很多缺乏。首先只是根据血管的分支将肺动脉分成了3组，并没有严格的根据血管直径进行划分;其次，本研究只是在细胞水平上进行的相关功能的研究，并没有在组织水平上研究低氧对于3组血管重构的影响;第三，关于低氧对3组PASMCs其他相关细胞功能，例如对细胞凋亡的功能影响有待进一步深切进入研究。综上所述，本研究在细胞水平上证实了肺大中小肺动脉PASMCs确实存在着功能上的差异，在低氧条件下，中小肺动脉组PASMCs增生及迁移能力更强。本实验结果为进一步研究肺小动脉易发生重构的机制提供了一定的理论根据。4以下为参考文献［1］SklepkiewiczP，SehermulyＲT，TianX，etal．Glycogensynthasekinase3betacontributestoproliferationofarterialsmoothmusclecellsinpulmonaryhypertension［J］．PLoSOne，2018，6(4):e18883．［2］ArcherSL，WuXC，ThebaudB，etal．Preferentialex-pressionandfunctionofvoltage-gated，O2-sensitiveK+channelsinresistancepulmonaryarteriesexplainsregionalheterogeneityinhypoxicpulmonaryvasoconstriction:ionicdiversityinsmoothmusclecells［J］．CircＲes，2004，95(3):308-318．［3］SchwenkeDO，PearsonJT，UmetaniK，etal．Imagingofthepulmonarycirculationintheclosed-chestratusingsyn-chrotronradiationmicroangiography［J］．JApplPhysiol(1985)，2007，102(2):787-793．［4］McLaughlinVV，McGoonMD．Pulmonaryarterialhyper-tension［J］．Circulation，2006，114(13):1417-1431．［5］HumbertM，MorrellNW，ArcherSL，etal．Cellularandmolecularpathobiologyofpulmonaryarterialhypertension［J］．JAmCollCardiol，2004，43(Suppl12):13-24．［6］MaddenJA，DawsonCA，HarderDＲ．Hypoxia-inducedactivationinsmallisolatedpulmonaryarteriesfromthecat［J］．JApplPhysiol，1985，59(1):113-118．［7］HislopA，ＲeidL．Newfindingsinpulmonaryarteriesofratswithhypoxia-inducedpulmonaryhypertension［J］．BrJExpPathol，1976，57(5):542-554．［8］LeikCE，WilleyA，GrahamMF，etal．Isolationandcul-tureofarterialsmoothmusclecellsfromhumanplacenta［J］．Hypertension，2004，43(4):837-840．［9］BarmanSA，ZhuS，HanG，etal．cAMPactivatesBKCachannelsinpulmonaryarterialsmoothmuscleviacGMP-de-pendentproteinkinase［J］．AmJPhysiolLungCellMolPhysiol，2003，284(6):L1004-1011．［10］SuzukiYJ，DayＲM，TanCC，etal．ActivationofGA-TA-4byserotonininpulmonaryarterysmoothmusclecells［J］．JBiolChem，2003，278(19):17525-17531．［11］StiebellehnerL，FridMG，ＲeevesJT，etal．Bovinedistalpulmonaryarterialmediaiscomposedofauniformpopula-tionofwell-differentiatedsmoothmusclecellswithlowpro-liferativecapabilities［J］．AmJPhysiolLungCellMolPhysiol，2003，285(4):L819-828．［12］ArcherSL．Diversityofphenotypeandfunctionofvascularsmoothmusclecells［J］．JLabClinMed，1996，127(6):524-529．［13］BakhramovA，EvansAM，KozlowskiＲZ．Differentia