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文档简介

目录

1、序列的

2、引物的设计及筛选

3、miRNA序列的

4、miRNA引物设计

序列的

NCBI：

qRT-PCR引物 cds（codingsequence）序列

mRNA=5'UTR+cds(编码蛋白）+3'UTR

引物设计原则

1.尽量不含发夹结构、二聚体、错配；

2.引物GC含量在40%~60%之间；

3.sense和anti-sense的Tm比较接近；

4.按照Rating评分由高到低选择（引物可自行编辑）。

miRNA序列

1.miRBase数据库：

2. 相应物种miRNA的成熟序列

插播内容：miRNA-5p与3p的认识

以hsa-miR-21为例：

hsa-miR-21-5p是指从hsa-mir-21前体的5’端臂加工而来，

hsa-miR-21-3p是指从hsa-mir-21前体的3’端臂加工而来；

表达水平较高的miRNA后面不加任何符号，而表达水平较低的miRNA后面加上*号，如hsa-miR-21*。有时带“*”的miRNA就根本不出现。

miRNA引物设计

1. miRprimer2软件使用

（见软件说明书）

2. 自己动手miRNA引物设计

自己动手miRNA引物设计-反转录引物

以hsa-miR-26a为例

成熟序列：UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU

颈环序列:

5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGGAC-3'

1.将U全部改成T

TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT

2.后面的6个碱基反响互补后加到颈环序列3'端

5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGGAC

AGCCTA-3'

自己动手miRNA引物设计-qRT-PCR引物

miRNA引物设计（茎环法+法检测）

设计方法：通用茎环后端加miRNA后面6个碱基的反向互补序列为反转录引物，正向引物为miRNA去除后面6个碱基的序列，反向引物在茎环上。

反转录茎环通用序列：

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGGAC

miRNA序列：

>mmu-miR-99b-5p

MIMAT MusmusculusmiR-99b-5p

CACCCGUAGAACCGACCUUGCG

mmu-miR-99b-5p反转录颈环引物为：

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGGACCG

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