灭菌与空气除菌

灭菌与空气除菌第1页，共55页，2023年，2月20日，星期一本章内容一、常用灭菌方法

二、培养基与发酵设备灭菌三、空气除菌第2页，共55页，2023年，2月20日，星期一第一节常用灭菌方法灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。

消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。

除菌(degermation):用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。

防腐(antisepsis):用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖

。第3页，共55页，2023年，2月20日，星期一发酵工业的无菌技术——灭菌方法干热灭菌法

湿热灭菌法

射线灭菌法

化学药剂灭菌法过滤除菌法火焰灭菌法

第4页，共55页，2023年，2月20日，星期一化学灭菌：一些化学物质与微生物细胞中某种成分产生化学反应。一般无法杀死所有微生物，只能杀死病原菌，所以起消毒剂作用。消毒剂：迅速杀灭病原菌微生物的药物。防腐剂：抑制或阻止微生物生长繁殖的药物。常用化学药剂：石碳酸、甲醛、氯化汞、碘酒、酒精等。第5页，共55页，2023年，2月20日，星期一主要用于：生产车间的环境、无菌室空间、接种操作前小型器具及双手的消毒灯。使用方法：浸泡、擦拭、喷洒、气态熏等。灭菌主要机理：一些化学物质（高锰酸钾、漂白粉等）与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，使蛋白质变性、核酸破坏、酶类失活、细胞膜透性改变而杀死微生物。第6页，共55页，2023年，2月20日，星期一射线灭菌：利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的γ射线进行灭菌的方法。波长范围：200~275nm紫外线，杀菌最强范围250~275nm,253.7nm最强。主要用于：接种室、超净工作台、无菌培养室、物质表面灭菌。30min作用力：杆菌>球菌>酵母霉菌第7页，共55页，2023年，2月20日，星期一作用机理：微生物在紫外线照射下细胞中DNA遭到破坏，形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合物，抑制DNA正常复制；空气在紫外线照射下产生臭氧也能杀菌。干热灭菌：在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度有关的氧化还原反应迅速增加，使微生物致死率迅速增高。160℃,1h。主要用于：玻璃器皿、金属器材和其他耐高温的物品灭菌。作用机理：干燥高温条件下，微生物细胞内各种与温度有关的氧化还原反应迅速增加，使微生物致死率提高。第8页，共55页，2023年，2月20日，星期一第二节培养基与设备灭菌**

（一）湿热灭菌原理

（二）分批灭菌（实罐灭菌）（三）连续灭菌（连消）（四）分批灭菌与连续灭菌的比较

第9页，共55页，2023年，2月20日，星期一湿热灭菌：高温使微生物体内的一些重要蛋白质发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死忙。用于：培养基、发酵设备、附属设备、管道和实验器材等。机理：蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，在高温蒸汽的作用下，使微生物细胞中蛋白质、酶核酸分子内部的化学键和氢键受到破坏，致使微生物再短时间内死亡。第10页，共55页，2023年，2月20日，星期一干湿热比较：湿热优于干热。一方面是细胞内蛋白质含水量较高；另一方面高温水蒸气对蛋白质有较高的穿透力，从而加速蛋白质变性而使微生物死亡。一般121℃维持20-30min。致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：杀死全部微生物所需的时间。例：微生物营养细胞在60℃加热10min。芽孢100℃加热10min---1h。第11页，共55页，2023年，2月20日，星期一1.热阻2.微生物热死定律：对数残留定律3.灭菌温度和时间的选择4.影响培养基灭菌的其它因素

（一）湿热灭菌原理第12页，共55页，2023年，2月20日，星期一1.热阻

定义：微生物对热的抵抗力称为热阻（微生物细胞在某一特定条件下死亡致死时间），可用比死亡速率常数k来表示。

k↓，热阻↑,t↑第13页，共55页，2023年，2月20日，星期一当温度T一定时，k随微生物不同而不同，具体计算时，可取细菌芽孢的k值为标准。当T变化时，k有很大变化，其变化遵从阿累尼乌斯定律

k=Aexp(-△E/RT)∴k与微生物活化能及T有关k越小，微生物越耐热1.热阻

第14页，共55页，2023年，2月20日，星期一大肠杆菌在不同温度下的残留曲线嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线第15页，共55页，2023年，2月20日，星期一第16页，共55页，2023年，2月20日，星期一2.微生物热死定律：

(1)对数残留定律

在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速度理论，微生物受热死亡的速率-dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N成正比称为残留定律，即

当Nt=0时，t=∞，

既无意义，也不可能。一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。第17页，共55页，2023年，2月20日，星期一菌体死亡属于一级动力学灭菌反应速度常数k是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。温度对k影响，遵从阿累尼乌斯定律

k=Aexp(-△E/RT)培养基在灭菌之前存在各种微生物，他们的k不相同，上式可写成同一微生物在不同灭菌温度下，k不同，灭菌温度越低，k越小；灭菌温度越高，k越大。第18页，共55页，2023年，2月20日，星期一(2)非对数残留定律

某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些微生物芽孢。

kRksNRNsNDdNR/dt=-kRNRdNs/dt=kRNR-ksNs→Nt/N0=KR/(kR-kS)[ekst-ks/kRe-kRt]

式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数

ND：死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率；

ks：敏感性芽孢的比死亡速率；

N0：初始活芽孢数。第19页，共55页，2023年，2月20日，星期一培养基中含有大量的不耐热的微生物和相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留曲线∴在T相同时，对数与非对数定律的灭菌时间t不同。第20页，共55页，2023年，2月20日，星期一3.

灭菌温度和时间的选择

培养物质受热破坏也可看作一级反应：式中C：对热不稳定物质的浓度；k’：分解速度常数；

k’的变化也遵循阿累尼乌斯方程：

都与相应的活化能及T有关第21页，共55页，2023年，2月20日，星期一当T1→T2

㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1(∵ΔE>ΔE’)∴随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌。3.

灭菌温度和时间的选择

第22页，共55页，2023年，2月20日，星期一4.影响培养基灭菌的因素

培养基成分油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。微生物细胞含水量。含水量越少，灭菌时间越长。第23页，共55页，2023年，2月20日，星期一pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。培养基的物理状态泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利，可加入少量消泡剂。培养基中的微生物数量搅拌冷空气排除情况4.影响培养基灭菌的其它因素

第24页，共55页，2023年，2月20日，星期一分空气过滤器灭菌并用空气吹干夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽达70℃左右取样管放料管通蒸汽120℃，1×105pa保温保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定罐压接近空气压力向罐内通无菌空气保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门夹套或蛇管中通冷水培养基降温到所需温度（二）分批灭菌（实罐灭菌）

1.灭菌工艺过程

第25页，共55页，2023年，2月20日，星期一升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式

㏑(N/N0)=-kt

来粗略估算灭菌所需时间。分批灭菌过程：升温、保温冷却3个阶段。2.

灭菌时间的估算

第26页，共55页，2023年，2月20日，星期一2.灭菌时间的估算

例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢，已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。

解：N0=40×106×2×105=8×1012(个)Nt=0.001(个)k=1.8(min-1)

㏑(Nt/N0)=-kt

t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)]=20.34(min)

由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培养基加热至1000C以上，这个作用较为显著，故实际保温阶段时间比计算值要短。

第27页，共55页，2023年，2月20日，星期一（三）连续灭菌（连消）

工艺流程喷淋冷却连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程灭菌时间的计算

㏑(Ct/C0)=－ktt=2.303/k[lg(C0/Ct)]

式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后的含菌数。

第28页，共55页，2023年，2月20日，星期一例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。连续灭菌时间的估算解：C0=2×105(个/ml)Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]=2.37min第29页，共55页，2023年，2月20日，星期一喷淋冷却连续灭菌流程第30页，共55页，2023年，2月20日，星期一第31页，共55页，2023年，2月20日，星期一分批灭菌与连续灭菌的比较

连续灭菌的优点：（适用于大型罐）可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小；可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。第32页，共55页，2023年，2月20日，星期一缺点：对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；蒸汽波动时灭菌不彻底；当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。不适合含有大量固体物料培养基灭菌。第33页，共55页，2023年，2月20日，星期一分批灭菌优点：不需其他设备，操作简单易行；不需设备进行加热冷却；适合小型发酵罐中培养基灭菌；适合含固体颗粒或较多泡沫培养基灭菌。缺点：对培养基营养成分破坏较大；培养基反复冷却耗能增加发酵周期延长；降低发酵罐利用率。

第34页，共55页，2023年，2月20日，星期一

第三节空气除菌

（一）发酵使用净化标准（二）空气过滤除菌流程（三）空气预处理（四）空气预处理流程设计应用举例（五）空气过滤介质（六）空气过滤除菌原理（七）提高过滤除菌效率的措施第35页，共55页，2023年，2月20日，星期一（一）发酵使用净化标准

空气除菌的必要性

以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期170h，那么每个周期需通气量2.86×105m3(50×0.7×0.8×170×60)，而每立方米大气中约有103-104个微生物。第36页，共55页，2023年，2月20日，星期一空气洁净度：洁净环境中空气含尘量多少的程度。第37页，共55页，2023年，2月20日，星期一（二）空气除菌流程第38页，共55页，2023年，2月20日，星期一1.

对空气过滤除菌流程的要求流程主要设备：空气压缩机、空气过滤器

附属设备：粗过滤器、气液分离器、空气贮罐、空气冷却器

第39页，共55页，2023年，2月20日，星期一流程的制定应根据所在地的地理、气候环境和设备条件综合考虑

环境污染比较严重的地方，要考虑改变吸风的条件；在温暖潮湿的南方，要加强除水设施；压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除油雾的污染，也可采用无油润滑的往复式压缩机；往复式压缩机，要配备前置粗过滤器及空气贮罐。通常要求压缩空气的相对湿度Φ=50%~60%时通过过滤器为好。1.

对空气过滤除菌流程的要求第40页，共55页，2023年，2月20日，星期一2.

空气除菌流程的分析空气除菌系统包括：冷却、分离油水、加热、过滤几种典型的设备流程

两级冷却、加热除菌流程

冷热空气直接混合式空气除菌流程高效前置过滤空气除菌流程将空气冷却至露点以上的流程利用热空气加热冷空气流程一次冷却和析水的空气过滤流程

第41页，共55页，2023年，2月20日，星期一

两级冷却、加热除菌流程图1-粗过滤器；2-空压机；3-贮罐；4，6-冷却器；5-旋风分离器；7-丝网分离器；8-加热器；9-过滤器

第42页，共55页，2023年，2月20日，星期一

冷热空气直接混合式空气除菌流程图1-粗过滤器；2-压缩机；3-贮罐；4-冷却器；5-丝网分离器；6-过滤器第43页，共55页，2023年，2月20日，星期一

利用热空气加热冷空气的流程示意图1-高空采风；2-粗过滤器；3-压缩机；4-热交换器；5-冷却器；6，7-析水器；8-空气总过滤器；9-空气分过滤器第44页，共55页，2023年，2月20日，星期一

将空气冷却至露点以上的流程1－高空采风；2－粗过滤器；3－压缩机；4－冷却器；5－冷却器；6－空气总过滤器；7－空气分过滤器第45页，共55页，2023年，2月20日，星期一

高效前置过滤空气除菌流程图1—高效前置过滤器；2—压缩机；3—贮罐；4—冷却器；5—丝网分离器；6—加热器；7—过滤器第46页，共55页，2023年，2月20日，星期一

一次冷却和析水的空气过滤流程示意图1－高空采风；2－粗过滤器；3－压缩机；4－冷却器；5，6—析水器；7—贮罐；8—加热器；9—空气总过滤器；10—空气分过滤器第47页，共55页，2023年，2月20日，星期一无菌空气制备过程包括两部分内容：一是对进入空气过滤器的空气进行预处理达到合适的空气状态，二是对空气进行过滤处理，除去微生物颗粒，满足生物细胞培养的需要。预处理的目的：一是提高压缩机空气洁净度，降低空气