植物染色体的标本制备

植物染色体的标本制备目前，国内外常用的植物染色体制片技术可以分为两种，即压片技术和去壁低渗技术。Belling(1921)提出植物染色体压片技术后，压片已成为植物染色体争论中最广泛应用的常片上，Omura和Kurata(1978)把植物原生质体技术应用到水稻染色体争论之中，用纤维素酶、果胶酶和0.075mol.L-1氯化钾处理取得了肯定的进展，陈瑞阳等人〔1979、1982〕提出了工外加机械压力使染色体分散张力使染色体分开。两种技术各有其优缺点，前者操作快速简便、省材省时，后者染色体效果，本试验主要介绍去壁低渗染色体制片技术。一、试验原理和压片，再置放在显微镜下观看，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。二、试验目的末期的染色体图象，并对其典型制片照像。三、试验材料大蒜Aillumsativu、洋葱Aillumcep〕的鳞基或蚕豆Viciafab〕的种子。四、试验内容1、植物染色体制片技术训练，独立完成植物根尖、茎尖及幼叶的取材、预处理、固定、制片、染色等染色体制片全过程，并获得图象清楚、完整、高度分散的染色体典型图象制片；2、染色体显微照相技术训练，用生物摄影显微镜，摄制某资源植物种典型的染色体图象403、细胞有丝分裂典型时期识别技能训练，通过大量的染色体图象观看，能比较快速准确地推断细胞有丝分裂前、中、后、末各个时期的。五、试验器具和药品1、设备：一般生物显微镜、NIKON数码摄影显微镜、数码相机及打印机、培育箱、恒温水浴锅；载玻片、盖玻片、镊子、不锈钢剪刀、单面刀片、磨口三角瓶、移液管、棕色200m(200ml20010m50m100m1000m〔1000m、滴瓶、滤纸、牙签、切片盒等；2、药品及配制8－羟基喹啉、秋水仙素、KCl、甲醇、冰乙酸、对二氯苯(白色结晶，有樟脑气味、密封保存、对中枢神经有抑制作用)、α-溴萘、NaCl、KHPONaHPOHCl、CaCl2 4 2 4 2洋红、45%醋酸、卡宝品红等试剂。试剂配制：0.002mol.L-18－〔染料中间体80.029g，先用少许乙醇溶解，100ml。0.011g100ml。5g40-45100mL5min1h，取上清液，10-20℃下预处理。0.075mol.L-1KCL溶液配制：称KCL5.592g，加少许鲜蒸馏水溶解后，定溶至1000ml。⑽45%醋酸溶液配制：95%冰乙酸，稀释成45%浓度。所需浓度〔45%〕=冰乙酸体积／溶液体积=45ml0.95／〔45+50〕0.1mol.L-1盐酸溶液配制：用移液器取浓盐酸0.85ml，加蒸馏水至100ml。36.5%1：250ml溶液中含HCL为0.25＊0.1＝0.025mol2：Hcl36.5g／mol那么需Hcl的质量为0.025*36.5＝0.9125克3：算出总共需要浓盐酸的质量为：0.9125／0.365＝2.5g41.18g/mL那么需要浓盐酸的体积为2.5/1.18=2.12〔毫升〕50mL45150mL火源，渐渐地参加0.5-1g洋红粉末〔留意不要一下倒入，以防溅出，过1-2min后，参加一锈铁钉，再过几分钟后取出铁钉〔使染色剂略含铁质，以增加染色性能，连续用微火加热1h〔避开阳光直射。如无洋红也可用地衣红代替，配制方法同前。此液常用于植物细胞核，特别是花粉母细胞的涂抹和压碎法染色，效果良好。卡宝品红〔Carborfuchsin〕试剂〔石碳酸品红〕的配制:称3g100ml70%A〔此液可以长期保存10mlA90ml15〔两周内使用，称为B原液。使用前，取B原液10m，参加90ml451.8充分溶解后备用。此液适用于植物核型分析、染色体形态观看。六、试验步骤1、取材一般来讲，但凡能进展细胞分裂的植物组织或单个细胞，都可以作为染色体制片材料；如根尖、茎尖、幼花、幼叶、幼胚、愈伤组织及正在分裂的大、小孢子母细胞等；正确取材活材料。先将种子浸泡11820℃〔黑暗〕培育405012cm10时左右剪取。⑴根尖1-2mm3/4以，根尖染色体制片的取材部位是根冠末端1-2mm的根段为宜。以洋葱为例，根冠区约0.5m1－2m3mm〔图9-1一般而言，用于染色体制片的根尖长度，以根冠末端1-2mm9-1洋葱跟尖纵切面，各局部细胞分裂的频率差异植物体细胞染色体的争论中材料获得的方法很多，常有种子发芽、鳞茎水培、扦插取根、引发气生根等。①种子萌发取根：生长强健的根尖不仅细胞分裂频率较高，而且染色体形态也比较平直，也就是所谓的“硬染色体态也多是扭曲的，也就是所谓的“软染色体度、生活力等品质性状好之外，还要求种子萌发条件最正确，获得最正确的“硬染色体②鳞茎水培：洋葱、水仙、蒜、风信子等材料多用此方法；在水培过程中，留意常常更换颖的同温水，是获得良好材料的关键。③扦插取根：杨、柳、桑、葡萄、菊花等扦插生殖植物多用此方法；在扦插生殖过程中，留意保湿通气，可以获得良好的根尖材料。⑵茎尖用能见生长锥的茎尖材料作为试验材料比较适宜分，广义上讲的芽，还包括有幼叶和腋芽原基。生长锥是茎的顶端分生细胞组织区，不同植物或同一植物的不同发育阶段，其生长锥的大小和外形都有较大的变化，他们可以是下凹、〔如禾本科丁香生长锥宽度<40μm，苏铁生长锥宽度达300μm。生长锥不同部位的细胞，其细胞分裂的胞的分裂周期短一倍左右；如曼佗罗生长锥中心区及叶原基区细胞分裂周期分别为76、36h，菊花生长锥中心区及叶原基区细胞分裂周期分别为140、70h。也就是说，生长锥则面1.0-1.5mm芽不宜用作染色体制片的材料。茎尖取材工作是比较繁复的，需要细心地剥掉全部幼叶，用扩大镜观看，能见生长锥时方可〔图9-。9-2茶叶叶芽纵切面图物种不同，生长锥的外形及宽度，因物种不同也不一样，且易受季节影响；所以，茎尖分子结晶的干扰。2、预处理作用，染色体严密地排列在赤道板上，很难将其分开,尤其是染色体数目较多的植物材料，很简洁产生染色体严峻重叠；而且因细胞分裂中期维持的时间短，一般仅10-30min，使中期染色体细胞消灭频率不高。为了抑制上述冲突，常用化学或物理方法对材料进展预处理。这些方法的作用机理及其作用是细体标本，反之，假设预处理失败，即使是很有阅历的人也难以制作出好的制片。⑵处理药剂化学药品有秋水仙素、8－羟基喹啉及对二氯苯。①秋水仙素ColchicinColchicuautumnal)种子或鳞茎中提取的一种生物碱，其分子式为C22H25NO6+1.5H2O，分子量为399.45。纯秋水仙素为针状结晶，商品多为白色或淡黄色粉末,融点155水中的溶解度差，不溶于苯。剧毒,易引起眼睛失明或中枢神径麻醉，使用时肯定要要留意安全。秋水仙素预处理的有效浓度为0.001-10.05-0.2%。8－羟基喹啉8-hydroxyquinolin其分子式为H8H3：CHC：C，145.1760℃、2－3h才完全溶解。8－羟基喹啉不仅具有晰，尤其在处理中、小型染色体比秋水仙素好，能使染色体、缢痕及随体的图象更清楚。常0.002mol/L0.004mol/Lp-dichlorobenzen:为一种苯的衍生物CH2Cl147.0。商品对二氯苯为无色结晶，大块时呈白色，具有特别臭味，常温下可以升华挥发醇、乙醚、苯等有机溶剂，难溶于水；易燃、有毒，通常用作防腐剂。对二氯苯比秋水仙素仅对纺锤体微管的组装有较强的阻抑作用，还可能对其他微管蛋白或某些细胞器有分解作用，能很大程度上转变细胞质粘度，称之为细胞质去除作用。因此，使染色体易于分散，尤5g40-45100mL5min，1h，取上清液，10-20℃下预处理。⑶低温处理1-46-8℃低温预处理能获得较好的效果。低温也有抑制纺垂体形成的作用，将活体材料或离体材料浸入蒸馏水，置于4℃冰箱中处理20-40取根尖1~2cm用0.01-0.2%秋水仙素溶液或对二氯苯饱和水溶液或0.002M8-羟基喹啉于4℃3-4h。3、固定背景清楚。=1:3，比较适宜于动物染色体标本制片；卡诺氏Ⅱ：冰乙酸:氯仿:无水乙醇=1:3:6=1：3，通用于多数生物染色体标本制片，近来普遍承受。经过前处理的根尖，用现配的卡诺Ⅰ固定液〔=3：1〕清洗一次处理过4℃冰箱内暗中固定24h；固定后的根尖用70%的酒精清洗2次后转入70%酒精中，在4℃冰箱中保存，保存时间最好不超过二个月。4、解离4-53-4次〔废水入塑料杯。0.1mol/LHCl8-10min，以浸泡住根为准。用镊子夹住外表皿边缘在酒精灯上间歇式加热2-4分钟〔觉察盐酸溶液有气泡冒出时，马上远离火焰〔乳白色，经解离，变化为透亮状608—10分钟。片观看。5、染色及压片于观看。因染色体被染色，呈现出原有的形态构造及数目，能进展植物染色体核型分析；因生物染色体上富含A－TG=C型分析。⑵常用药剂面简介国内外常用的几种染色剂。①洋红〔Carmine〕②地衣红〔Orcein〕③碱性品红〔Basicfuchsin〕④卡宝品红〔Carborfuchsin〕:31545%醋酸等试剂配制而成，具有染色快、着色深、适应性广的特点，是多数植物根尖、幼芽、花药以及细胞愈伤组织染色的好染料。⑤姬母萨Giems：最初用于DNA(parldue,1970从染色体染色效果来看，上述四种染色剂中，染色效果最好的是Giemsa，其次是卡宝品红，依次才是地衣红、锡夫〔Schiff〕试剂、洋红。加热的同时，不要加热到沸腾状态，假设沸腾马上停顿加热〔增加根染色程度〕1.5mm滴一滴固定液，在火焰上来回烤几下。再加一滴1%的醋酸洋红溶液，并盖上盖玻片，快速查后，选择抱负的分裂细胞，再在这个细胞四周轻小扣打，使重叠的染色体渐渐分散得到抱负的分裂相，最终形成薄雾状。要到达这个目的，必需把握以下几点：压片材料要少，避开细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展的余地。用镊子敲打盖玻片时，用力要均匀，假设在压片时稍不留意，使个别染色体丧失，而被迫放弃一个良好的分裂相的细胞6、试验观看染色体标本玻片枯燥后，先用10X低倍镜找分裂细胞区，在分裂细胞区内查找典型分裂相细胞。当找到含有红色条状物质的细胞轮廓图象后，再再