纳米基因药物课件

纳米基因药物

NANOGENEMEDICINEDec.20091Index1．概述2．纳米脂质体3．阳离子聚合物4．树状大分子5．病毒载体21．概述基因工程药物基因治疗与基因药物基因转导方法非病毒纳米基因载体31.2基因治疗与基因药物广义：将遗传物质导入人体组织或细胞达到预防和治疗疾病的目的狭义：对人体遗传物质进行修正、补充或改造来达到治疗疾病的目的基因治疗基因药物——用于基因治疗的药物51.3基因转导方法电穿透、显微注射、基因枪、碳化硅纤维介导ChemicalPhysicalBiological磷酸钙沉淀、DEAE介导、聚乙二醇介导、脂质体介导病毒载体、胚胎干细胞61.4非病毒纳米基因载体阳离子聚合物脂质体壳聚糖、多聚赖氨酸、树状大分子72.1阳离子纳米脂质体的组成1987年，Felgner，DOTMA+DOPE——Lipofectin阳离子纳米脂质体——阳离子脂质+中性辅助脂质1.阳离子脂质92.1阳离子纳米脂质体的组成1.阳离子脂质102.1阳离子纳米脂质体的组成1.阳离子脂质112.2阳离子纳米脂质体的结构小单层纳米脂质体(SUVs)20~100nm大单层纳米脂质体(LUVs)>100nm多层纳米脂质体(MLVs)300~700nm少层脂质体

已经商品化的阳离子脂质体Lipofectin

TransfectACE

LipofectAMINE(GIBCOBRL)TransfectamTfxTM-50(Promega)DC-Chol(Sigma)DOTAP(BoehringerMannheim)132.2阳离子纳米脂质体的结构SUVsorLUVsMLVs142.3阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制DNA/脂质体复合物内吞作用内体细胞核蛋白质细胞质治疗作用123456152.3阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制阳离子纳米脂质体与基因形成复合物复合物的形成及结构(2)复合物的理化性质

SIZEζ电位胶体化学稳定性影响因素——脂质体与DNA浓度介质的离子强度与温度样品加入顺序、混合速率静电模型内含模型细面条模型Radler模型“蜂窝”模型172.3阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制18192.3阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制3.阳离子纳米脂质体——DNA复合物在细胞内转运进入细胞——细胞内吞作用——内涵体——初级溶酶体与质膜直接融合——Rhodanine标记小孔模式——复合物修饰脱离内涵体——DOPE很好融合性——复合物与内涵体膜融合DNA向核转运——微丝微管作用复合物分解——内源性阴离子脂质方向突变orDNA游离细胞核摄取DNA——被动扩散or主动转运212.4纳米脂质体在基因治疗中的应用1.在肿瘤治疗方面的应用广泛应用于介导肿瘤治疗，动物实验或临床——黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌HLAB7+DC-Chol/DOPE——IV期恶性黑色素瘤(DMRIE/DOPE)E1A+DC-Chol/DOPE——乳腺癌p53+DOTAP/Chol——小鼠实验性肺癌222.4纳米脂质体在基因治疗中的应用2.在治疗肺部和呼吸道疾病中的应用肺——上皮表面——基因表达水平最高的靶器官肺囊性纤维化（CF）——常染色体隐性遗传综合征囊性纤维化跨膜传导调节因子CFTRcDNA+DOTAP/DOPEDC-Chol/DOPE部分患者出现炎性综合征233．阳离子聚合物阳离子聚合物——聚阳离子——表面带正电高分子聚合物

多肽类：聚赖氨酸PLL、聚谷氨酸PGA及其衍生物

多聚胺类：聚乙烯亚胺PEI、聚丙烯亚胺树状大分子PPI

聚甲基丙烯酸类：聚酰胺-胺型树状大分子PAMAM、聚甲基丙烯酸乙酯2-(二甲胺)

阳离子聚酯阳离子聚磷酸酯聚乙烯吡啶盐壳聚糖明胶优点：体内化学惰性+生物相容性粒径和表面性质可控——载体生理行为特殊结构与表面电荷——基因转移效率高聚合物基质降解速率可控——遗传物释放253.1阳离子聚合物/DNA纳米复合物的形成DNA——链状聚阴离子(PA)聚阳离子(PC)聚电解质纳米复合物静电作用过量的聚阳离子(PC)——复合物PC逐步加入到DNA溶液中更好地定位DNApH、温度升高——复合物MW、SIZE变大复合物可降低PC的毒性263.4常见的阳离子聚合物载体1.聚赖氨酸类载体聚-L-赖氨酸类载体PLL——20~50nm圆突体，40~80nm棒状转染效率不高，聚集，易被排除，细胞毒性唾液血清粘蛋白、转铁蛋白、叶酸、单抗修饰PEG、葡聚糖与PLL共聚，提高体内稳定性、转染效率其他氨基酸聚合物载体——鱼精蛋白、亚精胺、组蛋白鸟氨酸均聚物（PLO）转染校比PLL高10%聚谷氨酸，可生物降解性，低红细胞毒性29303.4常见的阳离子聚合物载体2.壳聚糖类载体壳聚糖——甲壳素碱性条件水解脱去部分乙酰基聚(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖胺壳聚糖/DNA纳米复合物制备与特性天然材料无毒，良好生物相容性，游离的氨基可质子化共凝聚——胶态复合物（硫酸钠）粒径大小——N/P比，壳聚糖分子量壳聚糖/DNA纳米粒子稳定性——交联键、pH壳聚糖及其衍生物的转染作用细胞类型、培养介质、pH、壳聚糖分子质量、313.4常见的阳离子聚合物载体3.聚乙烯亚胺类载体PEI特点——线型、支链型pKa——质子化能力——溶液浓度DNA压缩程度——N/PPEI/DNA复合物管状胶束、圆突形较多正电荷——毒副作用PEG化或修饰可解决此问题转染作用——PEI相对分子质量（25kD~800kD）（＜1.8kD）进入融酶体后，未完全质子化复合物结合H+——pH↑叶酸具有特殊的加强复合物转染活性的能力folate-PEG-PEI/DNA——无毒、高转染活性乳糖、半乳糖、脱辅基蛋白E——靶向性324．树状大分子1980s，美国化学家Tomalia博士发明334.1树状大分子的合成方法发散法会聚法PAMAM、PPI344.2树状大分子/DNA纳米复合物的形成静电引力——复合物形成高度压缩DNA——保护DNA粒径——50~100nmN/P>20——溶于水低密度复合物电荷密度——代数DNA≤10ng/mol——复合物悬浮于水354.3树状大分子基因载体的转染作用转染机制相同复合物可使胞膜出现15~40nm小孔特点——高稳定性、高溶解性缓冲pH值——热处理活化提高转染效率（分枝含氨基）可控——分子大小、形状、电荷、pKa、N/P比离体治疗——角膜内皮C、肿瘤C、鼠心脏C、兔颈动脉C问题——受免疫系统监控、聚阴离子攻击PEG、混合磷脂、非表面活性剂、IgA、血清成分修饰环化糊精364.4树状大分子的毒性复合物毒性低于树状大分子细胞毒性——细胞膜损伤、溶血细胞毒性随代数增加而增加，随电荷密度增加而增加多余阳性电荷活化补体系统——N/P聚氧乙烯和硅烷的树状共聚物(Csi-POE)COONa端基树状大分子PEG修饰、脂质体包裹可降低毒性无溶血毒性、细