动物实验graduate课件

如何做好动物实验——动物实验与动物实验技术2010.01“I’msoproud!Allofmykidsaregoingintoresearch”田枫2010.10.28主要内容动物实验中实验动物的选择实验动物模型影响动物实验的因素动物实验基本技术如何做好动物实验动物实验是根据研究目的，恰当地选用标准的实验动物品种、品系，进行各种科学实验，观察和记录动物的反应过程或反应结果，以探讨或检验生命科学中未知因素的一种活动。是生物研究中的重要方法之一，也是从动物身上获得有关情报资料的唯一手段。

关于动物实验相似性原则

利用与人体某些机能、代谢、结构及疾病特点的相似性选择实验动物组织结构：猪的皮肤组织结构与人类的相似系统机能：犬有发达的血液循环和神经系统，毒理方面反应和人也较接近繁殖特性：哺乳动物和人近似，性成熟、妊娠期和寿命一般是成比例的疾病特点：如旱獭肝炎病毒感染体液成分：鸟类粪尿混合排出；草食动物尿液呈碱性；肉食动物尿液呈酸性。选择时要注意解剖特性：有些动物的解剖结构与人类差别较大，要特别注意特殊性原则发热、解热和检查致热源实验-----适宜选用兔做实验；开胸和心脏实验----适宜选用兔做实验；观察药物对排卵的影响，进行避孕药研究-----适宜选用兔、猫；动脉粥样硬化实验-----适宜选用兔、猪、猴；肝外科实验研究------适宜选用大鼠；胆囊功能研究------不能选用大鼠；充分利用不同品种品系实验动物存在的某些特殊反应供研究用近交系小鼠

实

验

研

究

类

别

动

物

品

系心血管疾病DBA／2N自身免疫性疾病NZB／N、

脑积水 C57BL／KaLwN、D2／nSnN肾盂积水C57L／N、STR／N白内障STAR／N牙周病DBA／2N(有抗力)、STR／N(易感)多尿症STR／N、STR／1N白血病L615、L7212腭

裂A／HeN(自发)、C57BL／6N(诱发)放射线有抗力：C57BL／6N

敏感：BALB／cAnN，LACA．淀粉样变A／HeN，NZW／N补体BALB／cAnN(活性高)．DBA／2N(活性低)标准化原则选择与研究内容相匹配的标准化实验动物，以保证实验的准确性与可重复性。标准化动物系指经遗传学、微生物学、环境及营养控制而繁育的动物。规格化原则年龄----年龄不同，其生物学特性往往不同，一般选性成熟后的青壮年动物。太小的动物的生理功能未达到成年水平。太老的动物的各器官老化，代谢功能下降，只在老年医学研究中使用；体重----在正常营养状态和饲养条件下，体重与年龄有一定的相关性；性别----许多实验证明，同一品种（系）不同性别的动物对外界刺激的反应不一致。经济性原则无菌兔WhatistheAnimalModel?ananimalmodelinwhichnormativebiologyorbehaviorcanbestudied,orinwhichaspontaneousorinducedpathologicalprocesscanbeinvestigated,andinwhichthephenomenoninoneormorerespectsresemblesthesamephenomenoninhumansorotherspeciesofanimal.医学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和相关材料。ClassificationofAnimalModelsAccordingtocauseofthedevelopingSpontaneous(genetic)diseasemodels（自发）Induced(experimental)diseasemodels（诱发）Transgenicdiseasemodels（转基因）Negativediseasemodels

（抗疾病）Spontaneous(genetic)DiseaseModels

Thesemodelsofhumandiseaseusenaturallyoccurringgeneticvariants(mutants).Manyhundredsofstrainsandstockswithinheriteddisordersmodelingsimilarconditionsinhumanshavebeencharacterizedandconserved.指实验动物未经任何人工处置，在自然条件下动物自然发生、或由于基因突变的异常表现通过遗传育种保留下来的动物模型。血压测定心电测定C3HMiceCoatColor:BlackAgoutiFeatures:TheC3Hiswidelyusedasamodelfordrugtreatmentsofneurologicdisorderswithapplicationsintoxicologyandoncology.Highincidencerateofbreastcancerinfemalemiceandlivercancerinmale.Non-ObeseDiabetic(NOD)MiceCoatColor:AlbinoFeatures:TheNODexhibitsdestructiveautoimmunepancreaticinsulitisasearlyasfourweeksofage.Insulin-dependentdiabetesisseeninfemalesbythreemonthsofage.SenescenceAcceleratedMouse

EachSAMPstrainshowsrelativelystrainspecificage-associatedpathologies.Thesecharacteristicpathologicalphenotypesaresimilartoage-associateddisordersoftenobservedinelderhumans.Theyincludesenileosteoporosis,osteoarthrosis,age-relateddeficitsinlearningandmemorywith/withoutforebrainatrophy,presbycusis,senileamyloidosis,age-relatedimpairmentoftheimmuneresponseandsoon.

SAMP8SAMR1MorisAssessmentofSpontaneousModelAdvantages

Spontaneouslydeveloping（自然发生）

Similartohumandiseases（与人类疾病有较好的相似性）DisadvantageLimitedquantityanddifficulttoapply

（数量有限，应用有难度）InducedDiseaseModelsAsthenameimplies,inducedmodelsarehealthyanimalsinwhichtheconditiontobeinvestigatedisexperimentallyinduced.以物理的、化学的或生物的致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身一定的损害，出现某些类似人类疾病时的功能、代谢或形态结构方面的改变，以供研究用。Methods原位诱发：指将致癌物直接与动物靶组织或靶器官接触而诱发该组织或器官发生肿瘤，接触方法可通过涂抹、灌注、喂养或埋置等。异位诱发：将与致癌物接触后的动物组织或器官埋置于该动物或另一正常动物皮下而产生的该组织或器官的肿瘤。异位诱发肿瘤具有易于观察和取材的优点。诱癌物

放射线局部照射、化学致癌物（烷化剂、亚硝胺类、芳香胺类）、生物毒素（黄曲酶毒素）、细菌（幽门螺杆菌）等。

InducedTumorAnimalModelMethods实体瘤移植

肿瘤细胞皮下接种——7-10d处死荷瘤动物——选择生长良好、无坏死液化的瘤组织——2-3mm3+生理盐水或其它营养液——无菌套管针抽吸——接种同种受体动物右前腋窝皮下。腹水瘤移植

肿瘤细胞皮下接种——7-10d处死荷瘤动物——取腹水——含葡萄糖平衡盐水稀释至适当浓度——腹腔注射（腹水瘤）。TransplantTumorAnimalModelCardiovascularDiseasesAnimalModelAtherosclerosismodel：animalsfedbyhigh-fatandhighcholesteroldietornon-feedingmethodHypertensionmodel：kidneypacking、renalarterycoarctation、noisestimulusMyocardialischemiaandmyocardialinfarctionmodel：

electricstimulus、drugs、coronaryarteryblockageRespiratorySystemAnimalModelChronicbronchitisandpneumoniamodel：刺激性气体刺激（二氧化硫、烟雾、甲醛蒸气）Bronchialasthmamodel：

卵白蛋白激发：过敏原卵白蛋白注入豚鼠体内，其可溶性抗原刺激机体产生IgE抗体，使机体处于致敏状态。当豚鼠再次接触此抗原时，IgE介导发生抗原抗体反应，使细胞脱颗粒，释放出活性化学物质如组胺、嗜酸性粒细胞趋化因子等，作用于支气管引起气道高反应致哮喘。

血小板活性因子(PAF)诱发：目前已知的唯一能引起气道高反应性炎症介质。DiabetesModel

注射致高血糖因子，如生长激素、胰高糖素、糖皮质激素以及儿茶酚胺类激素等。注射化学物质引起胰岛β细胞的损伤，如链脲佐菌素(STZ)、四氧嘧啶可造成胰岛β细胞不可逆损伤；环丙庚哌、天门冬素酶等可引起β细胞可逆性损伤。注射生物及生物制品引起β细胞破坏，如鼠脑炎、心肌炎病毒M型变异可诱发若干品系的成年小鼠糖尿病。手术切除胰腺的大部分或全部，并给予高糖饮食刺激，引起继发性永久性糖尿病。AssessmentofInducedModelQuantityenough（数量足够）Conditionaccord（条件一致）和自然产生的疾病模型在某些方面存在一定差异。ImmunodeficiencyAnimalModelAnimalsiscertainorsomeimmunodeficiencybecauseofspontaneousorartificialmethods.由于先天遗传突变或用人工方法造成免疫系统某种或多种成分缺陷的动物。ClassificationofImmunodeficiencyAnimal

CongenitalImmunodeficiencyanimal

（先天性）

T-lymphocytedeficiencyanimal：nudemice,nuderatsB-lymphocytedeficiencyanimal：CBA/NmiceNKcelldeficiencyanimal：Beigemice

Severecombinedimmunedeficiency：SCIDmiceAcquiredimmunodeficiencysyndrom（获得性）

primate,miceandcatAIDSmodelHistoryofNudeMice1962年英国格拉斯哥医院Grist在非近交系的小鼠中偶然发现有个别小鼠无毛。1966年证实是由于第11对染色体基因突变所致。1968年，Pantelouris解剖发现裸鼠失去了正常的胸腺。1969年Rygaard首先将人结肠腺癌移植裸小鼠获得成功。

由于裸鼠原种抵抗力差，生育力低，寿命短，不能用于实际。和纯系BALB/C，C3H，C57BL/6小鼠交配，不断选育，获得了三种近交系鼠（InbredNudeMice）新种。裸鼠自发现以来，广泛应用于肿瘤学、免疫学和病毒学等多个学科的研究。KMHairlessMiceA:Heterozygousmiceat10months.B,C:Homozygousmiceat10months.Themutantmouseiscoveredwithsparsehair,andcannotopenitseyesnormallyScd1ab-XymutationB-lymphocyteDeficiencyAnimalCBA/N

BcellfunctionislowSevereCombined

ImmuneDeficiencyAnimalSCIDmiceCoatColor:Albino

由于第16对染色体隐性基因突变，纯合突变导致淋巴细胞抗原受体基因VDJ区域重排的重组酶活性异常，基因重排时断裂无法正常连接，从而影响B、T细胞的正常功能分化。外观体重与普通小鼠相同。对鼠肝炎，巴氏杆菌、卡氏肺囊虫极易感染，感染后易发病死亡。SPF环境没有B、T阳性标志细胞，对外来抗原无细胞和体液免疫NK、LAK细胞功能正常或增高；FeatureofSCIDTheC.B-17-sciddoesexhibitextremelylowlevelsofIgin~20%ofthemiceat12weeksofage.TheincidenceofIgwillincreaseasthemiceage.Despitethis“leakiness”（渗漏）C.B-17-scid'sdonotmountanantibodyresponsetochallengebyimmunogenicmaterial.

(部分小鼠出现低水平的功能性T和B细胞,血清中Ig含量明显升高)。

SHO（SCIDHairlessOutbred）人们一直想让SCID小鼠拥有裸鼠无毛的优点CharlesRiverLab的研究人员自2007年开始就着手培育无毛的SCID小鼠，他们通过Crl:HA-Prkdcscid和Crl:SKH1-Hrhr这两个品系杂交，最终在2008年得到了两条染色体上均带有SCID基因的无毛封闭群小鼠模型SHO（SCIDHairlessOutbred）.2008年6月，实验人员通过对比的方法将人前列腺癌细胞株PC-3分别接种到SCID和SHO身上，研究发现，SHO除去具有与SCID小鼠相同的肿瘤生长特性之外，还摒除了Nu/Nu裸鼠接种PC-3时出现的皮肤溃疡现象。Other

ImmuneDeficiencyAnimalNZBWF1

野生色WBB6F1—W/WV

（WB—W/+♀XC5TBL/6—WV/+）F1Anaemia,gastriculcer，bonemarrowfailuremodelWhite,blackeye动物模型复制原则相似性可重复性可靠性适用性和可控性易行性和经济性疾病动物模型的注意事项没有一种动物模型能完全复制人类疾病，模型实验结论的正确性只是相对的，最终必须在人体身上得到验证。尽可能使模型动物处于最小的变动和最少的干扰之中；动物进化的高级程度并不意味着所有器官和功能接近于人的程度；不能盲目使用近交系动物；查找文献并咨询动物实验所需动物和条件是否可行，了解前人所积累的经验，避免低水平的重复或缺乏科学依据的盲动所造成人力物力的浪费。影响动物实验的因素R=(A+B+C)×D+ER:实验动物的总反应A:动物种间的共同反应B:动物品种，品系特有的反应C:动物的个体反应D:环境因素（包括实验处理）E:实验误差A,B,C是由实验动物本身的遗传因素决定的，被选择的实验动物，在严格控制环境因素D或改变其中某一条件后就可能得到一个理想的实验结果R。动物对实验处理的反应可用以下公式表示：小鼠肝炎病毒感染裸鼠的肝脏病变wastesyndrome出现消耗性疾病，给肿瘤免疫学研究造成严重干扰仙台病毒感染仙台病毒感染肺病变对麻醉实验和吸入毒理学研究等产生严重干扰最适宜温度20-24℃，温差：3或4℃温度不同种类动物“热平衡”区的范围不同。在热平衡区，动物呈基础代谢率。如果环境温度降至低于热平衡区温度的下限，动物的代谢率将呈线性增长。如果环境温度高于热平衡区温度的上限，代谢率也将增长，这不是防御机制，而是由于环境温度导致体温升高，升高的体温提高了代谢率。因此，环境温度高于热平衡区比低于它使动物的应激反应更强烈。

湿度Ringtail:

Lowenvironmentalhumidity,hightemperatures,anddraftspredisposeyoungratsandmicetodevelopannularconstrictionsofthetailandoccasionallyfeetordigits.Localizededemacanleadtodrygangreneandtissuesloughing.噪声（Noise）噪音是实验动物发生应激反应的常见原因。引起动物紧张，导致不安和骚动。国家标准≤60dB超过100dB的噪声，能够引起某些品系的小鼠、大鼠和仓鼠发生抽搐；能够引起动物心跳、呼吸次数增加，引起大鼠血液甘油三酯水平升高和血压升高，而血糖降低；我们难以使房间内笼具的环境条件完全相等，因此，实验动物应在笼架中自由的分布，尤其对照组动物和给药组动物在笼架的位置应是自由分布的。此外，在塑料和金属笼具中动物的反应也会不同。笼具（Cages）

笼具必须易于清洗和足够坚固。不透明笼具可能最适于动物生长，尽管这些笼具给实验观察带来不便，而且观察在不透明笼具中的动物可能会打扰它们。一个笼子中可以放多少只动物？经验告诉我们是每笼2-5只动物变异最低，动物单笼饲养变异高，当每笼动物数量超过5只时变异同样迅速攀升。饲养密度——每笼动物数（Numberofanimalspercage）饲养密度饲养密度身处狭小笼中，实验小鼠精神失常。英国和瑞士的研究人员曾安装一台24小时监控的摄像机，记录了实验小鼠的一举一动。老鼠们反复地做着同一动作。其中有些老鼠沿着笼子的不锈钢毫不费力地爬到顶部，前腿挂在天花板上，嘴则咬住笼栏，而后又跳到笼子底部。而另一只老鼠则在不停地翻跟斗，每秒钟一个，一口气能翻40分钟。它们每一个动作的目的就是为了不停地重复整套动作，而且做得那么认真执著，与精神病人的表现一模一样，毫无二致。势力范围

Malemicewillfightwhenfirstco-mingledinacage,andtheyneedtobeobservedverycloselyduringthistimeofestablishingasocialdominancehierarchywithinthegroup.Weakandnon-aggressiveanimalsmightbeinjuredorkilledifnotremovedfromthecage.大多数动物已经形成了对人类的不信任，倾向于逃离人类。经过小心的捉拿操作和逐渐的适应，动物能够在某种程度上学会调整其逃走的本能。粗暴的捉拿操作和新的员工可再激活动物逃跑的本能，并可能影响到实验结果。动物实验基本技术主要内容抓取与固定编号方法给药方法采血方法麻醉方法处死方法职业安全无害化处理AnimalRestraintMouse-AvoidgraspingandpullingthetipofthetailRatTailshouldbeliftedonlyatthebaseandforshortperiod,tailskinmaytearRestrainerofMiceandRatGuineapigHoldwithtwohandsRabbitUsetwohandsforliftingandshouldnotberestrainedbytheearsRestrainerofRabbitDog性别鉴定Furcoloring-picricacid染色法：一般适用于短期实验，大小鼠常用。原则：动物背部朝上头顶1、右前肢2、右侧腰部3、右后肢4、尾跟部5、左后肢6、左侧腰部7、左前肢8、背部9、不标号0或10

后面的数字永远大于前面的数字，如12、23、56、89、123、345等等；而没有11、21、43、65等等。Earpunching152金属耳号玻璃管动物标记(微芯片microchip)）1、可以标记的动物种类多2、体内标签，不易破坏3、使用寿命长，达到20年,可循环使用4、准确率高，读错率为10万分之一5、可以准确标记每一个动物动物标签编码规则3位国家代码+3位地区代码+12位动物标签编码如：国码：720区域：899序号：2玻璃管动物标签注射器注射（植入）标签前一定要保证消毒到位，以避免不必要的感染玻璃管动物标签阅读器注射（植入）标签时应15-45度角注射，方便阅读器以之发生电磁感应，敏捷地读出数据。玻璃管动物标签阅读器的最佳阅读距离为7-12CM，不要太近或太远纹身皮下注射腹腔注射肌肉注射VeinInjectionofMouseVeinInjectionofRabbitVeinInjectionofDogGavagingMethodofMouseGavagingMethodofRabbitInjectionvolumeinmillilitersAnimalSCIMIVIPRat5-80.30.55-10Mouse2-30.20.052-3Hamster3-40.10.33-4G.P.5-100.50.55-8Rabbit30-500.5-11-550-100人与动物的给药量换算方法人与动物对同一药物的耐受性相差很大。一般情况下，动物的耐受性比人大，也就是单位体重动物的用药量比人要大。一般可按下列比例换算：人用药量为1；小鼠、大鼠为25-50；豚鼠、家兔为15-20；犬、猫为5-10。BleedingRequiringanesthesiaCardiacpunctureJugularveinPosteriorvenacavaLateralsaphenousvein(GP)NotrequiringanesthesiaOphthalmicvenousplexusTailveinEarveinCephalicvein(rabbit,dogs,cat)LateralsaphenousveinToe&tailclipingBleeding(cont.)Maximumamountofbloodthatcanbesafelyremovedforbloodcollection=1%ofbodyweight.Totalbloodvolumeisapproximately6%ofbodyweighte.g.5kgrabbitX1%=50mlbloodAnimalproduce0.75-1.0ml/kg/dayofblood5kgrabbit,1ml/kg=Xml/5kg,X=5ml/dayItwilltakes10daysfortheanimalstoreplacethe50mlthatwerewithdrawnOphthalmicvenousplexusCardiacpuncture实验动物的采尿方法代谢笼法：能将尿液和粪便分开而达到收集动物尿液目的的特殊装置。适用于大、小鼠。导尿法：适用于雄性兔、犬等。实验动物的麻醉动物麻醉目的：消除动物手术疼痛，便于实验操作，保证动物安全，为手术创造良好的条件。麻醉的意义：第一是善待动物，第二是提高动物实验的效率。全身麻醉：

局部麻醉：（普鲁卡因、利多卡因等）挥发性麻醉剂：吸入给药——乙醚、氯仿等非挥发性麻醉剂：静脉、皮下、肌肉、腹腔给药——氯胺酮、戊巴比妥钠等实验动物的安乐死(euthanasia)

指以人道的方法处死动物的过程。处死过程中尽量减少其惊恐和焦虑，使其安静地无痛苦的死亡。

安乐死必须符合的标准：1.死亡时尽可能减少惊恐、疼痛。2.使其在最短时间内失去意识迅速死亡。3.方法可靠且可重复。4.对操作人员安全。5.采用的方法要与研究的要求和目的一致。6.对观察者和操作者的情绪影响最小。7.对环境污染的影响最小。8.需要的机械设备简单，价廉，易操作。9.处死动物的地点应远离并与动物房分开。Euthanasia(cont.)-RodentsAcceptableInhalantanestheticoverdoseCOCO2BarbiturateoverdoseMicrowaveirraditationConditionallyacceptableN2(sedatedoranesthetized)ArgonCervicaldislocation(BW<200g)DecapitationEuthanasia(cont.)-UnacceptableHumaneconcernsDecompressionDrowningStrychnineForuseinconsciousanimalsExsanguinationRapidfreezingAirembolismSolemethodNicotineMagnesiumsulfatePotassiumchlorideAllcurariformagentsStunningHazardoustohumansChloroformCyanide常用脊椎动物安乐死方法小于125g啮齿动物125g—1kg啮齿动物/兔1-5kg啮齿动物/兔狗猫非人灵长类反刍动物、马、猪二氧化碳OOONNNNXBarbiturate注射液，静脉注射OOOOOOOBarbiturate注射液，腹腔注射OOONONO先麻醉，之后放血致死OOOOOOO先麻醉，之后静脉注射KCl(2mmol/kg)OOOOOOO先麻醉，之后断头OOMNNNN先麻醉，之后颈椎脱臼OONNNNN动物清醒中直接断头MMMNNNN动物清醒中直接颈椎脱臼MNNNNNN电昏后放血致死NNNNNNO说明：O:建议使用方法；N:不得使用方法；M:一般情况不推荐使用，除非实验需要。OccupationalHealthandSafetyProgramforPersonnelwithLaboratoryAnimalContactRiskAssessment:AllergiesBitesandScratchesSharpsinjuries(punctures,cuts,etc.)ChemicalExposureZoonoticDiseaseSHARPSIfneedlesareused,needlesarenottobepurposelybentorbrokenbyhand,removedfromdisposablesyringesorotherwisemanipulatedbyhand.Needlesshouldnotberecappedunlessabsolutelynecessary.Ifneedlesmustberecapped,asingle-handedtechniqueshouldbeused.SHARPSForsharpsthatposeadefinitepuncturepotential,anapprovedsharpscontainerisapunctureandleakresistantcontainer(i.e.,aredsharpscontainer).污物的无害化处理一次性口罩、帽子等使用后应装入专用垃圾袋回收焚烧处理。一次性使用的注射器、针头、手套等物品使用后经消毒剂浸泡清洗，毁形后按要求统一进行无害化处理。绝不可自行处理和随意扔掉。用过的废垫料要装入垃圾袋中或专用的垫料容器内，注意防蝇、防渗漏，并及时焚烧处理。进行放射性实验所产生的废弃物，如果属于短半衰期且放射性较低的物品，放置6-10个半衰期后可以焚化处理。其他放射性废弃物，应进行中、长期安全包装后送放射性废物处理站处理。如何做好动物实验？1、明确目的及必要性

首先要弄清其目的是什么,动物实验也不例外。只有明确动物实验的目的,才能避免实验的盲目性,真正做到有的放矢,少走弯路,节约经费和时间,从而达到科学、节俭和高效。2、确认必要性“3R”原则动物实验伦理和动物福利3、作好实验设计对照原则

随机化原则

重复原则均衡性原则如何做好动物实验？4、选择适宜的实验动物

实验动物遗传特性的选择实验动物微生物等级的选择