植物细胞大规模培养及有用物质生产

植物细胞大规模培养及有用物质生产第1页，共59页，2023年，2月20日，星期五

植物次生代谢产物：植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。（一）、概述

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植物产生代谢产物的类型根据分子结构不同大致分为：

酚类化合物：黄酮类；醌类（苯醌、萘醌、蒽醌）萜类化合物：三萜皂甙；甾体皂甙；单萜、倍半萜、二萜含氮化合物：生物碱；胺类（伯、仲、叔、季胺）非蛋白氨基酸生氰甙多炔类、有机酸第3页，共59页，2023年，2月20日，星期五

植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。李时珍在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害是理想的环保产品。

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自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较生产方式生产周期紫草宁含量（％干重）完整植物2～3年1～2植物细胞培养3周14第5页，共59页，2023年，2月20日，星期五植物次生代谢产品的市场潜能产品成分用途年销售额（亿美元）长春花碱治疗白血病18～20（美国）奎宁治疗疟疾5～10（美国）致热素杀虫剂20（全世界）毛地黄心脏病药20～55（美国）第6页，共59页，2023年，2月20日，星期五

植物细胞大规模培养的技术要求：

从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和次生代谢产物生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件：

1、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。

2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。

3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。第7页，共59页，2023年，2月20日，星期五（二）、植物细胞规模化培养体系的建立

1、种子细胞的选择

（1）准确选择能产生目的化合物的植物种类；（2）尽量选择自然状态下产生天然产物的组织器官为外植体；

(3)高产种子细胞克隆的方法：单细胞培养后，将单细胞扩增形成的愈伤组织分2份，1份成分含量分析，另1份保留培养。第8页，共59页，2023年，2月20日，星期五2、种子细胞系的增殖与放大培养种子细胞增殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶体积从几百毫升到几升逐级放大。当细胞数量增加到一定值后，应转移至体积较小的生物反应器培养。第9页，共59页，2023年，2月20日，星期五3、大规模培养体系的建立

（1）成批培养：在一个培养体积中接种细胞或添加培养基后，中途不添加也不更换培养基的方式。

（2）连续培养：在培养过程中，不断向反应器中以一定流量添加新培养基，同时以一定流量从系统中取出培养基的方式。

(3)半连续培养：在完成成批培养的一个周期后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养的方式。第10页，共59页，2023年，2月20日，星期五(三)生物反应器类型及特点大规模培养系统基本原理方法与上述实验室悬浮培养一致，但大规模培养所采用的设备及控制技术比实验室小规模培养要复杂的多。

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植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易团聚等特点。同时，植物细胞规模培养的目的是生产天然产物，所以，植物细胞培养反应器的设计不仅要考虑有利于细胞生长，还要考虑有利于产物的积累和分离。总体上，适合植物细胞培养的反应器应具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。第12页，共59页，2023年，2月20日，星期五机械搅拌式培养系统

机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；为便于取样观察，一般还设计有取样口。

第13页，共59页，2023年，2月20日，星期五生物反应器第14页，共59页，2023年，2月20日，星期五StirredTankBioreactorsAnexternalmotorisusedtoagitatethegrowthmediumwithimpellers.Sterileairorcombinationsofgasescanbeintroduced(sparkling)第15页，共59页，2023年，2月20日，星期五气压搅拌式培养系统

考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。

第16页，共59页，2023年，2月20日，星期五BubbleColumnBioreactor

(AirliftReactor)Introductionofsterileairorpuregases

isusedbothforagitationandoxygenation第17页，共59页，2023年，2月20日，星期五InternalLoopAirliftBioreactorTubeplacedinsidethereactorcreatesinternalcirculationloop

第18页，共59页，2023年，2月20日，星期五ExternalLoopAirliftBioreactorCirculationthroughanexternalloop

第19页，共59页，2023年，2月20日，星期五旋转式培养系统

一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。

第20页，共59页，2023年，2月20日，星期五②固定化培养系统这一技术的优点在于：

可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节；细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。第21页，共59页，2023年，2月20日，星期五细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：

包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。

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1、利用细胞培养生产有用物质的一般程序（1）选材

应注意以下条件：①药效肯定；②对其有效成分有充分的了解；③有测定有效成分和药理的可靠方法；④市场短缺或价格昂贵；⑤取有药效成分的部位，且该部位较易形成愈伤组织。（四）、利用细胞培养生产有用物质第23页，共59页，2023年，2月20日，星期五

（2）细胞株系建立

将诱导产生的愈伤组织进行分离，建立悬浮细胞繁殖体系（液体培养）。

在工厂化生产中，为了提高有用物质产品的产量和质量，对细胞培养的选择有两个基本要求：①有用物质的合成积累能力强②生长速度快

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（3）大量培养

将选出的优良细胞株扩大繁殖后，可作为细胞工厂化培养的生产“种子”，进行大量培养。

（4）产品提取与纯化从植物细胞培养物中提取和纯化有的产品。第25页，共59页，2023年，2月20日，星期五2、提高有用物质生产效率的技术因素

①筛选高产细胞系

从实验材料中筛选高产的细胞株系是提高生产率、降低生产成本的重要因素。特异的次生代谢产物往往是特异的器官中形成的。因此，用特异器官为材料，建立特异功能的细胞系，并从中反复多代培养选择有效的、高产的细胞株。

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筛选出的高效、高产细胞株系，有的植物细胞系其高效、高产性能稳定多年，但有的植物细胞系不稳定，因此，还需要定期检测，更新细胞株系。第27页，共59页，2023年，2月20日，星期五

第一步：解决生物量生产（促进细胞裂）；第二步：促进次生代谢物合成，即在细胞指数生长停止期前后才更换培养基，有利于次生物质的积累。

②、二步培养法第28页，共59页，2023年，2月20日，星期五③、培养基中添加前体前体：有用次生代谢物的前驱物。烟草愈伤组织培养中，将前体物质—烟碱酸加入，会增加烟碱的生成量。第29页，共59页，2023年，2月20日，星期五

④、培养基中生长调节剂的作用

植物生长调节剂不仅影响植物的脱分化与再分化，而且能影响次生代谢物质的产生。如烟草愈伤组织培养中，培养基中添加IAA，能合成烟碱，而在含有2,4-D的培养基上，烟碱合成受阻。

第30页，共59页，2023年，2月20日，星期五⑤、培养条件的影响光照、温度等影响次生代谢。在胡萝卜愈伤组织培养中，光照条件使紫红色愈伤组织能够生成大量的花箐苷，并且低温条件下，生成量高。

第31页，共59页，2023年，2月20日，星期五⑥、采用固相细胞培养系统

细胞生长分裂旺盛时，次生代谢物产量低。采用固相培养，将细胞培养在惰性基质中，细胞生长缓慢，可提高次生代谢物质的产量。第32页，共59页，2023年，2月20日，星期五思考题1．一个好的悬浮细胞系有哪些特征？用于建立悬浮细胞系的愈伤组织有何要求？2．建立悬浮细胞系的关键技术有哪些？3．悬浮细胞系在继代培养中其群体生长规律？4．细胞大规模培养有哪些培养系统？第33页，共59页，2023年，2月20日，星期五第34页，共59页，2023年，2月20日，星期五第35页，共59页，2023年，2月20日，星期五紫杉醇：二萜类化合物最早由太平洋红豆杉Taxus

brevifolia的树皮中分离广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等十几种癌症目前主要来源于红豆杉属植物紫杉醇简介第36页，共59页，2023年，2月20日，星期五理化性质英文名：Paclitaxel,Taxol®orTM分子式：C47H51NO4水溶性：0.7mg／ml稳定性：pH4～8稳定；pH<4较稳定；pH>8易分解；在特定条件下紫杉醇可被氧化，但极难还原；第37页，共59页，2023年，2月20日，星期五紫杉醇研发过程年代进展1958NCI开始大规模植物药研发筛选1967

发现紫杉醇抗癌活性1968

从红豆杉中分离出紫杉醇1971

完成结构鉴定1979

发表作用机制1983

临床Ⅰ试验1985

临床II期1991

临床III期1992

FDA批准上市NCI称其为过去15年中开发的最好的抗癌药物20世纪90年代抗肿瘤药的三大成就之一汤姆森科技桂冠奖RameshPanchagnula,InternationalJournalofPharmaceutics.1998(172)1-15.第38页，共59页，2023年，2月20日，星期五市场需求抗癌一线用药

销售额年增长率5亿美元

理论需求量

2g/人,500万人/年

1000kg/年实际销量

350kg/年紫杉醇供需相差十分悬殊

图1：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）图2：国际紫杉醇销售额（亿美元）第39页，共59页，2023年，2月20日，星期五紫杉醇开发的关键问题上游产业——药源问题

下游制剂产业药效（活性、水溶性）安全性生物相容性第40页，共59页，2023年，2月20日，星期五药源问题红豆杉

主要原料植物国家一级保护野生植物，全球十大濒危物种之一生长缓慢分布有限Taxol含量低

树皮中Taxol含量:0.00001-0.069%3000棵树=10吨树皮=1kgTaxol=500病人第41页，共59页，2023年，2月20日，星期五人工栽培采用种子繁殖、扦插等无性繁殖方法快速、大面积人工繁育红豆杉幼苗寻找红豆衫的替代物

从红豆杉非树皮部位提取产紫杉醇的非红豆杉植物优点：生长周期缩短简便、直接缺点：1、紫杉醇含量低生长缓慢

2、提取工艺复杂药源问题解决办法（一）第42页，共59页，2023年，2月20日，星期五药源问题解决办法（二）化学合成全合成

1994年获得成功现有六种途径半合成以10-DABⅢ和BaccatinⅢ作为半合成原料获得紫杉醇新方法用10-DAT缺点：1、合成过程烦琐复杂，几十步

2、费用高，化学试剂昂贵

3、总收率太低（2%）优点：1、原料枝叶含量丰富、提取相对容易，充分利用再生资源

2、产率高

3、最具实用价值可以工业化生产

4、获取紫杉醇构效关系信息，进行结构改造缺点：合成过程相对复杂（11步化学转化和7步分离）第43页，共59页，2023年，2月20日，星期五药源问题解决办法（三）生物方法组织和细胞培养微生物发酵生物合成研究阶段红豆杉生物合成途径基本明确

10种相关酶基因被克隆表达利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量

优点：1、摆脱自然因素，可长期稳定生长

2、适应市场、方便调节

3、成分简单，有利于分离纯化

4、成本低、生长周期短

5、为半合成提供原料

6、有望工业化生产缺点：1、产量低、不稳定

2、工业化放大研究第44页，共59页，2023年，2月20日，星期五紫杉醇水溶性很差0.77mM/L使用增溶剂：聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇

存在问题稳定性和水溶性较差（7mm/L）过敏反应产生沉淀缺点：1、产量低、不稳定

2、工业化放大研究药效问题第45页，共59页，2023年，2月20日，星期五一、植物来源药物的特点全世界有40%的药物来源于植物。我国是中草药资源最丰富的国家，有详细记载的近5000种。中草药治疗疾病的历史上千年，中医药已形成完整的科学体系。对于植物药效成分的研究已形成“天然药物化学”研究的新领域。药用植物中具有药物功能的物质种类繁多，结构复杂。除小分子的天然有机化合物以外，还有多种生物大分子活性物质。

对不同组方的药用成分和功能的研究是一项巨大的工程，相当于基因组和蛋白质组工程。中药复方复杂系统研究（北京大学韩启德院士）第46页，共59页，2023年，2月20日，星期五二、植物来源药物的种类

1、天然有机化合物（1）糖和糖苷类（2）苯丙素类：苯丙烯、苯丙酸、香豆素等（3）醌类：辅酶Q10、紫草素（4）黄酮类：黄酮醇、花色素

（5）鞣质：奎宁酸、槲皮醇。（6）萜类：青蒿素、齐墩果酸（7）甾体：乌沙苷元、毛第黄毒苷元（8）生物碱：咖啡因、喜树碱第47页，共59页，2023年，2月20日，星期五2、植物蛋白质、多肽、酶类生理活性物质表2-163、植物糖类药物包括单糖、聚糖和糖衍生物。表2-174、植物脂类药物（1）脂肪和脂肪酸类：亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸（2）磷脂类：大豆磷脂（3）固醇类：豆固醇、β-谷固醇。第48页，共59页，2023年，2月20日，星期五三、植物来源药物的植被实例

1、植物SOD2、植酸钙镁与肌醇

3、植物不饱和脂肪酸四、植物药物来源的研究前景

1、植物细胞培养

2、植物组织培养

3、有效成分的分离、纯化，结构和功能测定。第49页，共59页，202