杂交瘤技术和单克隆抗体技术

杂交瘤技术和单克隆抗体技术第1页，共22页，2023年，2月20日，星期五

体液介导的适应性免疫反应：体液反应引发产生可结合外来抗原的循环抗体，由B淋巴细胞产生，由辅助T淋巴细胞介导是抗体技术的基础。细胞介导的适应性免疫反应：毒性T淋巴细胞结合于外来或感染的细胞，随后将这些细胞裂解，辅助T细胞参与该反应。二、免疫系统能特异性地对无数种分子反应。免疫系统持续地受无数抗原刺激。免疫系统的一个主要形式是它能合成大量的抗体及细胞表面受体。各个带有不同抗原结合位点的抗体和T细胞受体与外来分子的结合提供了免疫反应特异性的基础。第2页，共22页，2023年，2月20日，星期五三、个别淋巴细胞识别个别抗原一个细胞识别一个抗原，因为单一淋巴细胞上的所有抗原受体是相同的。在成熟淋巴细胞表面的所有受体都是糖蛋白，体细胞基因重组、突变及基因转录后加工等使受体产生107个以上的结合位点。抗原特异性通过确保只有一个类型的受体在一个细胞内被合成的过程来维持。虽然B细胞表面抗体和T细胞表面受体都具有类似的结构，但它们是由不同的基因家族编码的，其表达具有细胞型的特异性。B细胞上的表面抗体能结合可溶性抗原，而T细胞受体仅仅识别在其它细胞表面展示的抗原第3页，共22页，2023年，2月20日，星期五四、免疫系统能将外来微生物和分子与自身成分区别开来。五、系统记忆每一次与外来抗原的遭遇免疫反应遇到同一抗原时一次比一次强，具有特异性。免疫记忆可以延续动物终生。六、免疫反应的许多性质是通过克隆选择确定的一种抗原活化一种淋巴细胞。当淋巴细胞表面受体结合抗原时，B淋巴细胞就被活化，分泌抗体被刺激而增殖（急剧分裂克隆）。七、一个有效免疫系统的成熟是由广泛的细胞间信息交换来调节的。第4页，共22页，2023年，2月20日，星期五第二节、抗体分子抗体是具有共同结构和功能形式的一大类糖蛋白。抗体分成五类：IgG、IgM、IgA、IgE和IgD（见表2-1）。一、IgG类抗体有两个相同的抗原结合位点含有抗原结合位点的两个区域被称作Fab片段，涉及到免疫调节的蛋白区称作Fc片段，在Fab和Fc片段之间的部分称作铰链区。重链分子量为5.5kDlt；轻链分子量为2.5kDlt。二、不同类型抗体的区别IgG、IgM、IgA、IgE和IgD因重链形式不同而有所区别。它们的重链分别称作γ、μ、α、ε和δ。重链的不同使这些蛋白具有不同形式的免疫功能，并且在完成反应成熟的不同阶段发挥作用。这些差异主要是由于Fc片段上的蛋白序列不同所致。轻链只有两种：κ、λ。第5页，共22页，2023年，2月20日，星期五三、抗体轻链的分子结构比较轻链的氨基酸结构发现，轻链有一个恒定区和一个可变区。轻链由220个氨基酸组成，分为两个区，每个区由大约110个氨基酸组成。-NH2末端那半部分是异源性的，称为可变区（V）；羧基末端那部分称为恒定区（C）。恒定区有两种类型：一种是决定κ轻链的，另一种是决定λ轻链的。κ轻链基因位于第6染色体上，而λ轻链的基因则位于第16染色体上。四、抗体重链的分子结构重链的序列也存在可变区和恒定区（图2-1）。IgG重链含有一个可变区和三个恒定区，每区含110个氨基酸，其它重链含有附加的恒定区。IgG重链序列也显示γ链有四种亚类，即：IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。鼠重链多肽编码区在第12染色体上。第6页，共22页，2023年，2月20日，星期五第7页，共22页，2023年，2月20日，星期五第8页，共22页，2023年，2月20日，星期五五、重链和轻链的可变区形成抗原结合位点一个重链的可变区和一个轻链的可变区结合形成一个抗原结合位点。可变区的异质性提供了动物有效进行免疫反应所需的无数结合位点的基础。序列异质性并不是由整个可变区的每一部分决定的，而是集中在与抗原接触的位点上。多数可变性决定于每一个链的三个短区，它们形成轻链的三个超变区和重链的三个超变区。这些超变区形成抗原抗体结合的接触残基的主体，同时这些超变区位于扩展进入抗原反应区的短环上。由于它们是实际的抗原结合位点，故被认为是互补决定区。六、功能性κ、λ轻链和重链基因的一个明显特征是在所有细胞中这些基因转录后的选择性剪接是不同的（见图2）。200个V区，4个功能性J区。七、形成λ轻链pre-mRNA外显子也要重排（图3）。V-J-C-J-C。八、形成功能性重链基因需要pre-mRNA外显子的重排（图4）。50—100种可变区，12个D区，4个J区。第9页，共22页，2023年，2月20日，星期五第10页，共22页，2023年，2月20日，星期五第11页，共22页，2023年，2月20日，星期五第12页，共22页，2023年，2月20日，星期五第13页，共22页，2023年，2月20日，星期五第14页，共22页，2023年，2月20日，星期五九、这些重组及其它机制产生了无数的抗原结合位点。十、等位基因排斥确保在任一B细胞中只有重新排列的一个轻链和一个重链被表达。产生不同重链和轻链的基因重组不总是产生一个功能基因，在B细胞分化过程中，轻链重排开始于κ区内。然后，若二倍体基因中的一个首先重排，产生一个功能性等位基因，另一个拷贝则进行重组。若二个重组都产生非功能性等位基因，那么重组就要λ位点开始，以同样的机制产生功能性重链。一旦重组产生一个功能性抗体，一个未知的机制就制止进一步重组。将抗原性结合位点固定，直到细胞死亡。这个机制叫等位基因排斥。它可以解释为什么B淋巴细胞分泌的只有一种抗原结合位点的抗体和抗体只有一种类型的轻链。十一、其它：重组被用于生产各种类和亚类的抗体。

第15页，共22页，2023年，2月20日，星期五淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体技术1960年，法国的Barski等首先发现，两种不同类型的细胞在混合培养的过程中会自发融合形成融合细胞。与此同时，日本的Okada也发现紫外线灭活的仙台病毒(Sandaivirus)可以诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合，在此基础上用灭活的仙台病毒诱导产生了第一个种间的杂交细胞。

1976年Kohler和Milstein创建了一个方法，他们将分泌一种特异性抗体的B细胞和体外持续生长的浆细胞瘤融合，产生的杂交细胞克隆表达了抗体生成的正常B细胞和浆细胞瘤细胞的免疫球蛋白基因，同时也具有在体外无限增殖的能力。为此创造了杂交瘤(hybridoma)这个名词，以描述一个正常抗体生成细胞和一个浆细胞瘤细胞的融合产物。由于他们的重要科学贡献，Kohler和Milstein在1984年荣获了诺贝尔医学生理奖。

第16页，共22页，2023年，2月20日，星期五第17页，共22页，2023年，2月20日，星期五一、免疫原性

许多外源分子、病毒或细胞单纯注射在实验动物体内能引起强的抗体反应，而一些物质却不能，对于这些情况，常可通过修饰抗原或改变宿主而使免疫系统反应增加。好的免疫原分子必须具备以下条件：

1、抗原结合于原始B细胞表面抗体分子对于抗体反应是绝对必要的。这个结合决定了产生抗体的特异性。因为表面抗体分子上的抗原决定位点与分泌抗体的结合位点是一致的。

2、它必须能促进B细胞与辅助T细胞间的信息交换。这要求在两个细胞间有物理连接。即有一个位点被II级蛋白及T细胞受体所识别。

3、通常它必须可被降解。第18页，共22页，2023年，2月20日，星期五二、抗原来源开始一个免疫程序之前，对制备抗原的考虑主要于抗原所需的剂量和纯度。这应基于预计产生抗体的用途。如果仅仅需要识别相应抗原的高特异性抗体，那么抗原必须要相当纯，或抗原制备物用于制备单克隆抗体。

1、纯抗原

2、从聚丙烯酰胺凝胶中纯化抗原。

3、半抗原：半抗原若被偶联于大的蛋白分子上就能被用于诱发抗体。半抗原起抗原决定簇作用，与B细胞表面抗体结合，载体提供II级T细胞受体结合位点。总之，半抗原应被偶联于可溶性载体上，如BSA。

4、合成多肽也要连接到载体上。第19页，共22页，2023年，2月20日，星期五三、动物免疫1、动物选择

Balb/c小鼠，6~8周龄；兔子生后约12周。动物数：小鼠4~6只；兔子2~4只。2、佐剂免疫反应的非特异性刺激物叫做佐剂，诱导对可溶性抗原的抗体反应必须使用佐剂。但对颗粒性抗原或全细胞抗原则不是必须的。佐剂包含两种因素：一是佐剂是储备性物质以防止抗原迅速代谢；二是佐剂必须是可以非特异性地刺激免疫反应的物质。实验时一般是将水溶液注入到佐剂中。3、抗原剂量对于兔，若有大量可溶的纯抗原可用，一般认为每次免疫于佐剂中有0.5~1.0mg剂量是可取的；对于小鼠来讲，剂量则降10倍，为50~100μg。第20页，共22页，2023年，2月20日，星期五4、抗原的形式5、注射途径：需考虑三个问题。

1）要注射多大剂量；

2）与免疫原同注的是什么缓冲液，还有其它什么成分；

3）免疫原释放入淋巴系统及循环系统的速度如何？对于兔，大体积注射常采用皮下多点注射。对于鼠，大体积注射常采用腹腔注射，若需缓慢释放则采用肌注或皮下注射，若需立即释放宜采用静脉注射。对于鼠来说，第二次和第三次免疫应间隔至少3周。对于兔来说，每3~6周注射一次。超免疫化动物血清主要含IgG抗体。其实