放免技术的资料

放免技术的资料第1页/共70页第一节概述一、荧光的基本知识二、荧光物质第二节荧光抗体技术一、标本的制作二、荧光抗体的制备三、荧光抗体染色与结果判断四、荧光显微镜的基本结构第三节荧光免疫分析的类型一、时间分辨荧光免疫测定二、荧光偏振免疫测定三、荧光酶免疫测定第四节荧光免疫技术在医学检验中的应用一、荧光抗体技术的应用二、荧光免疫测定的应用第2页/共70页

第一节概述

第3页/共70页荧光（fluorescence）

荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。

一、荧光的基本知识取决于物质本身的结构及其周围的介质环境光致荧光化学荧光阴极射线荧光第4页/共70页发射光谱和激发光谱

发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。

荧光的基本知识第5页/共70页荧光效率定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式:

荧光效率=

如何得到最高的荧光效率？荧光的基本知识第6页/共70页荧光淬灭

定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、亚甲蓝、碱性复红、低浓度的高锰酸钾、I-等。作用：以减弱非特异性本底。荧光的基本知识第7页/共70页荧光寿命定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。

荧光的基本知识第8页/共70页荧光偏振

FH－FLP＝──────

FH＋FL荧光的基本知识第9页/共70页荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。

具备的条件二、荧光物质（1）具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合蛋白质后不易解离，而未与蛋白质结合的色素及其降解产物容易被清除；（2）荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率；（3）荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明。（4）结合蛋白质后，不影响蛋白质的生化性质及免疫学活性，而且色素与蛋白质结合的方法简单而快速，结合物稳定，易于保存。（5）安全无毒，不具有附加的抗原性。第10页/共70页荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橘红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术Eu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定常用的荧光物质第11页/共70页

第二节

荧光抗体技术

第12页/共70页荧光抗体技术的基本原理

荧光色素与特异性抗体以共价键牢固结合，而不影响该免疫血清的抗体活性，成为荧光标记的抗体，在一定条件下使之在涂片上或组织切片上与标本中的待测抗原特异性地结合，然后采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，激发标本中结合的荧光素而产生荧光，借助荧光检测仪察看荧光现象或测量荧光强度，从而判断抗原或抗体的有无、定位和分布情况，或检测受检标本中抗原（抗体）的含量等。第13页/共70页荧光抗体技术的内容

抗体的纯化抗体的荧光色素标记标记抗体的纯化荧光标记抗体染色荧光显微镜检查第14页/共70页抗体要求

高纯度高特异性高亲和力高效价一、荧光抗体的制备第15页/共70页有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。荧光素要求荧光抗体的制备第16页/共70页抗体的荧光素标记标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基（-NH2）与FITC的异硫氰基(-N=C=S)在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标记方法:

搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。

透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异染色较低，但荧光素用量多。荧光抗体的制备第17页/共70页温度、时间pH蛋白含量荧光素纯度荧光素用量荧光抗体标记影响因素荧光抗体的制备第18页/共70页去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收荧光抗体的纯化荧光抗体的制备目的？第19页/共70页荧光素与蛋白结合率：

F/P=抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性：免疫电泳或交叉免疫电泳抗体特异性染色滴度：倍比稀释荧光抗体的鉴定荧光抗体的制备第20页/共70页-20℃：保存1～2年真空干燥：长期保存荧光抗体的保存荧光抗体的制备第21页/共70页组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织

涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液培养细胞：单层培养细胞标本的类型二、标本的制作第22页/共70页冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。

石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。组织切片的类型标本的制作第23页/共70页固定剂：丙酮、乙醇、甲醇、甲醛等

保存：立即使用或-20℃保存标本的固定和保存标本的制作第24页/共70页直接法直接荧光抗体染色法示意图荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。三、荧光抗体染色及结果判断第25页/共70页间接法特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。

间接荧光抗体染色法示意图荧光抗体染色及结果判断第26页/共70页双标记法

两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。荧光抗体染色及结果判断第27页/共70页

设立实验对照:阳性对照和阴性对照

区分特异和非特异染色

阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色及结果判断第28页/共70页

“-”：无或仅见极微弱荧光。

“+”：荧光较弱但清楚可见。

“++”：荧光明亮。

“+++”：耀眼强荧光。特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。

荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色及结果判断第29页/共70页荧光显微镜

利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。

四、荧光显微镜的基本结构第30页/共70页光源：高压汞灯、氙灯滤光片：隔热、激发和吸收滤光片光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器镜头：消色差镜头

荧光显微镜荧光显微镜的基本结构第31页/共70页隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长的光域，提供合适的激发光。

吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。荧光显微镜滤光片荧光显微镜的基本结构第32页/共70页透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。透射荧光显微镜光路(a)落射荧光显微镜光路(b)荧光显微镜光路荧光显微镜的基本结构第33页/共70页

第三节

流式荧光免疫技术

第34页/共70页

第四节

荧光免疫分析的类型

第35页/共70页荧光免疫分析的基本原理

将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。第36页/共70页荧光抗体技术荧光免疫测定均相荧光免疫测定（homogeneousfluorescenceimmunoassay）

非均相荧光免疫测定（heterogeneousfluorescenceimmunoassay）荧光免疫技术荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。荧光免疫技术的类型第37页/共70页荧光免疫测定的方法类型

非均相荧光免疫测定：

时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定均相荧光免疫测定：

荧光偏振免疫测定第38页/共70页自发荧光寿命短:1ns～10ns镧系元素寿命长:10μs～1000μs短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光基本原理时间分辨检测原理示意图时间分辨一、时间分辨荧光免疫测定第39页/共70页stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠stokes位移基本原理时间分辨荧光免疫测定第40页/共70页发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少激发光谱带较宽：30nm～500nm，灵敏度高基本原理发射光谱和激发光谱时间分辨荧光免疫测定第41页/共70页比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高基本原理荧光标记物的相对比活性时间分辨荧光免疫测定第42页/共70页结合β-二酮体Eu3+解离酸性增强液荧光增强Eu3+标记抗原抗体复合物基本原理信号增强时间分辨荧光免疫测定第43页/共70页

镧系元素铕(Eu3+)（最常用）钐(Sm3+)铽(Tb3+)钕(Nd3+)镝(Dy3+)标记物荧光物质荧光寿命(ns)荧光物质荧光寿命(ns)非特异荧光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰氯14Dy3+-PTA1000罗丹明B3.0常见荧光物质的荧光寿命时间分辨荧光免疫测定第44页/共70页标记方法

双功能螯合剂：1-（对-苯偶氮）-EDTA异硫氰酸苯基-EDTA异硫氰酸苯甲基-DTTA二乙烯三胺五乙酸（DTPA）标记方法：一步法：先螯合Eu3+，再连接蛋白质二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3+时间分辨荧光免疫测定第45页/共70页方法类型

双抗体夹心法固相抗体竞争法固相抗原竞争法时间分辨荧光免疫测定第46页/共70页方法类型时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图双抗体夹心法固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物，酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。时间分辨荧光免疫测定第47页/共70页方法类型固相抗体竞争法待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。时间分辨荧光免疫测定第48页/共70页方法类型固相抗原竞争法待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。时间分辨荧光免疫测定第49页/共70页灵敏度高：最小检出量10-18mol/L分析范围宽：4～5个数量级标记物稳定：有效使用期长测量快速，易自动化易受污染，本底增高方法评价时间分辨荧光免疫测定第50页/共70页光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光称为偏振光。偏振荧光(绿光,525nm～550nm)偏振光(蓝光,485nm)荧光物质基本原理二、荧光偏振免疫测定第51页/共70页

抗原抗体竞争反应AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱待检抗原含量与偏振荧光强度成反比荧光偏振免疫测定原理示意图基本原理荧光偏振免疫测定第52页/共70页方法评价

样品用量少荧光素标记试剂稳定，使用寿命长重复性好快速，易自动化适于小、中等分子物质检测灵敏度较非均相荧光免疫测定法低荧光偏振免疫测定第53页/共70页基本原理荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图

碱性磷酸酶标记抗体或抗原，固相载体包被抗原或抗体，酶分解4-MUP，脱磷酸根基团形成4-MU，360nm激发光照射，发出450nm荧光。三、荧光酶免疫测定第54页/共70页酶和荧光底物荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物

标记酶底物荧光产物激发光(nm)荧光(nm)相应信号碱性磷酸酶4-MUP4-MU36045010β-半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根过氧化物酶HPA二聚体3174140.03荧光酶免疫测定第55页/共70页方法类型

双抗体夹心法双抗原夹心法固相抗原竞争法荧光酶免疫测定第56页/共70页方法类型双抗体夹心法固相抗体和酶标记抗体与待检原反应，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物进行酶促发光反应，发光量与待检抗原含量成正比。荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）示意图荧光酶免疫测定第57页/共70页方法类型双抗原夹心法固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物，加入底物进行酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比。

荧光酶免疫测定第58页/共70页方法类型固相抗原竞争法待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤除去未结合部分，固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原含量成反比。荧光酶免疫测定第59页/共70页方法评价

用酶和荧光底物的化学反应作为放大系统，提高灵敏度背景荧光干扰测定，用固相荧光酶免疫测定效果好荧光酶免疫测定第60页/共70页

第四节

荧光免疫技术在医学检验中的应用

第61页/共70页①自身抗体检测抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)抗核抗体(斑点型)一、荧光抗体技术的应用第62页/共70页②病原体检测寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌)荧光抗体技术的应用第63页/共70页③免疫病理检测肿瘤（人肝癌细胞）荧光抗体技术的应用第64页/共70页④细胞表面抗原和受体检测将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检