分离纯化复习

下游加工技术：从工程菌或工程细胞的大规模培养到产品的分离与纯化所需的一系列单元操作。生物分离与纯化：从动植物组织、微生物培养产物或细胞培养产物中分离及纯化目的产物的过程。凝聚：在某些电解质作用下，破坏细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。絮凝：使用絮凝剂，在悬浮粒子之间产生架桥作用，而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。细胞壁：是包在细胞质膜表面的非常坚韧和复杂的结构，具有保护细胞、抵御外界环境破坏、保持细胞形状、提供稳定渗透压、执行生化功能、控制营养和代谢产物交换的功能。水通量：采用纯水在一定条件下（25£、0・35MPa）的透水率，单位为m3/m2•d或ml/cm2emin萃取技术：利用溶质在互不相容的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。珠磨法：将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种破碎程度。高压匀浆法原理：利用高压使细胞液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环，使细胞破碎。超声波法原理：空穴作用。在超声波的作用下形成空穴，这种空穴泡又受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，促使细胞内液体发生流动，造成了剪切应力，促使细胞破碎。酶解法原理：利用酶反应分解破坏细胞壁成分的特殊化学键，使细胞破碎。化学渗透法：某些化学试剂可改变细胞壁或膜的渗透性，从而释放目的产物细胞破碎率:被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数方法：一、直接测定法二、测定释放的蛋白质量或酶的活力三、测定电导率细胞碎片的特点：粘度大；胶体物质多；尺寸范围广（0・2~14|皿）细胞碎片的分离方法： 一、离心沉降二、微孔膜过滤（MF）优点：投资少、能耗低，不受液固比重差的影响包含体—当某些外源基因在寄主细胞内表达后，形成的蛋白质产物在胞内凝聚成不具生物活性的固体颗粒。例如干扰素、人生长激素、白细胞介素等。包含体产物分离的一般过程：破碎细胞T分离包含体T溶解包含体T目的产物构型复原常用的变性剂：盐酸胍（6mol/L目的产物复性方法：稀释法，透析法沉淀法特点：成本低、收率高、浓缩倍数高、操作简单等。种类：盐析法；有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；聚电解质沉淀法；生物盐复合沉淀法；热变形或酸碱变形沉淀法盐析法：高浓度的中性盐能促使蛋白质等发生沉淀或絮凝现象盐析法会出现两种：“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大。“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：（a）无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；（b）中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀；Ks代表直线的斜率，可以看出，Ks与温度和pH值无关，但与蛋白质和盐的种类有关。卩大小主要取决于不同蛋白质性质，与溶液的温度和pH有关，但与盐的种类无关盐析法的种类：1.“K”分级盐析法在一定的pH和温度下，改变离子强度或盐浓度的沉淀方法。2・“卩”分级盐析法在一定的离子强度下，改变溶液的pH和温度的沉淀方法。最常用的盐析剂：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或磷酸钠影响盐析的主要因素(1)蛋白质的初始浓度当蛋白质起始浓度高时，在相同收率下盐用量小；当蛋白质起始浓度低，需用较多的盐；一般宜用稀一些的蛋白质浓度，常采用2.5%〜3.0%o(2)离子强度和种类的影响当溶液中离子强度不断增加时，蛋白质的溶解度又会逐渐降低，而发生盐析现象。即离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。离子半径小、电荷高的离子——影响较强；离子半径大、电荷低的离子——影响较弱。Ks值越大，就表示该盐的盐析效果越好(3)温度对盐析的影响温度升高溶解度增加。但在高盐浓度中，蛋白质等生物大分子物质的溶解度随温度的升高反而下降。原因：蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热，温度升高有利于蛋白质失水沉淀。对易失活的物质可在0~4°C下进行，如酶的提取。(4)pH对盐析的影响通常溶解度值在等电点附近有最小值pH的选择原则：不降低产物活性；对于蛋白质物质，则选择等电点时的pH等电点沉淀法原理：利用两性电解质在电中性时溶解度最低的原理进行分离纯化两性电解质：抗生素、氨基酸、核苷酸等小分子物质，蛋白质、酶、核酸等生物大分子物质。等电点沉淀优点:许多蛋白质的等电点都在偏酸性的范围内，而许多无机酸的价格低廉，且能为食品标准允许缺点：酸化时容易引起蛋白质失活，因为蛋白质对低pH比较敏感。等电点法适用于憎水性较强的两性电解质有机溶剂沉淀法：利用与水可以互溶的有机溶剂使产物沉淀的方法。应用：酶制剂、氨基酸、抗生素等发酵产物的提取有机溶剂沉淀的原理：有机溶剂f降低水溶液的介电常数f溶质分子间的静电力增加f溶解度下降f沉淀特点：1.分辨能力比盐析法高2.溶剂残留易除去3.沉淀物易分离4.大分子易变性失活5.安全问题——应在低温下进行有机溶剂的选择：①能与水混溶②无毒③生物活性影响有机溶剂沉淀的因素:⑴有机溶剂的种类⑵温度⑶pH⑷样品浓度和分子质量⑸金属离子和离子强度的影响非离子型多聚物沉淀法：多聚物与大分子物能发生共沉作用，可使大分子物的水化度降低。常用多聚物：聚乙二醇(PEG)、葡聚糖右旋糖酐硫酸钠影响因素：①沉淀剂浓度的影响②离子浓度③pH④PEG分子量特点：操作条件温和，对活性有保护作用；沉淀效能高，沉淀后分离容易，多聚物可除去。聚电解质沉淀法聚电解质物质：离子型的多糖化合物、阳离子聚合物、阴离子聚合物。机理：主要靠静电引力，沉淀蛋白质物质时的作用方式与絮凝剂类似。泡沫分离是以气泡为介质，利用组分的表面活性差进行分离的一种分离方法泡沫分离的原理：组分在气-液界面上吸附的选择性和程度，其本质是各种物质在用叶重表面活性的差异。临界胶团浓度(CMC)：表面活性剂在水溶液形成胶团的最低浓度表面过剩：在气液两相界面处的表面活性物质浓度与主溶液不同泡沫分离的基本过程：1.代分离的溶质被吸附到气-液界面上2.对被泡沫吸附的物质进行收集并用化学、热或机械的方法破坏泡沫，将溶质提取出来。主要的设备为泡沫柱和消泡器泡沫分离的工艺流程：间歇泡沫分离；连续泡沫分离；多柱串联泡沫分离影响泡沫分离因素：料液性质；表面活性剂；操作条件；泡沫柱泡沫分离的优点：1.设备简单，容易放大2.操作简单，能耗低3.可连续和间歇操作4.在下游加工过程的初期使用，处理体积庞大的稀料液5.可直接用于处理含有细胞或细胞碎片的料液6.分离效率高萃取：利用液体为溶剂提取原料中目的产物的分离纯化操作反萃取：完成萃取后，为进一步纯化目标产物或便于下一步分离操作的实施，常需要将目标产物从有机相转移到水相的萃取操作物理萃取：溶质扩散到溶剂中，萃取剂与溶质间不发生化学反应化学萃取：溶剂选择性地与溶质化合或络合萃取分离机理：混合物中的各组分在相同溶剂中的溶解度不同，从而分离浓缩萃取法包括：液-液萃取；双水相萃取；固-液萃取液液萃取的工艺流程：1.培养液预处理2.混合分离3.产品回收和溶剂回收液液萃取的应用条件：1.稀溶液2.溶质始终为一种分子，不发生络合或解离3.溶质对溶剂与水的互溶度无影响液液萃取溶剂选择原则：1.Kff溶剂用量减少〜浓缩倍数ff提取效果好P分离效果f2.溶剂与溶液的关系a•互溶度小b・粘度低，界面张力适中，避免出现乳化现象c・比重差大：二者易分离，即利用沉淀分离就行3•毒性低4•其他a・回收容易，稳定性好b・价廉易得c・安全性，腐蚀性do蒸汽压低液液萃取操作条件：温度PH常用的双水相系统：PEG/葡聚糖；PEG/无机盐影响物质分配的因素：1・聚合物及其相对分子质量的影响2・系线长度对分配平衡的影响3・离子环境对分配的影响4・pH的影响5•温度的影响提高固液萃取效率的途径：1提高固相的细碎度2搅拌3不断更换新鲜溶剂4适当提高温度适应性：①某些胞内产物灰链霉素、制霉菌素、淀粉酶、蛋白酶②固态法生产的产物糖化酶、纤维素酶③残留在滤渣中的有效成分色层分离的特点：1、分离效率高2、应用范围广3、操作参数多，选择性强4、高灵敏度的在线检测5、快速分离6、过程自动化操作色层分离种类：1按分离机理分（即按溶质分子与固定相相互作用的不同）①吸附色层分离法②分配色层③离子交换色层④凝胶色层⑤亲和色层2根据固定相的形状不同①色层柱（柱层析）②纸色层（纸层析）③薄层色层（薄层层析色层分离选择原则：①目标产物分子结构、物理化学特性、分子量大小②主要杂质的成分和含量③目标产物的稳定性大分子活性物质——凝胶色层、亲和色层；小分子代谢物——吸附、离子交换。如：抗生素分析色层、制备色层、工业色层的比较①操作上：进样量不同分析色层：要求进样量越小越好，向毛细管柱色层发展；制备色层：要求进样量越多越好②理论上：理论塔板数的不同：分析色层——进样类似活塞型——塔板数可计算；工业色层——进样不一致（流动相流动不同步）——塔板数不可精确计③溶质浓度：分析色层：由于浓度较低，溶质在两相中的关系成线性关系，即CS=KdCm，为线性色层；工业色层：浓度高，不成线性关系一非线性色层④保留值不同分析色层：保留值为常数；工业色层：保留值与样品浓度有关展开：加入洗脱剂，使各组分分层的操作。洗脱液：洗脱时，从柱中流出的溶液。色谱：展开后各组分的分布状况。常用的色谱分离技术：一、吸附色谱1、原理：利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力展开剂的选择：展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大。展开剂选择的原则：（1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小（2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力吸附色谱的操作程序：（1）根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相。（2）吸附操作3）洗脱采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物二、分配色谱原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法2、构成要素：固定相、载体、流动相载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体载体种类：硅胶、硅藻土、纤维素、葡聚糖凝胶固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相流动相可以是极性的（反相色谱法），也可以是非极性的（正相色谱）HPLC是一种典型的分配色谱经过了多次的吸附一解析一吸附的过程反相液相色谱分离多肽和蛋白质是基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求三、离子交换色谱：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法常用的离子交换树脂：1）强酸性阳离子交换树脂2）弱酸性阳离子交换树脂（3）强碱性阴离子交换树脂4）弱碱性阴离子交换树脂影响交换速度的因素（1）颗粒大小：愈小越快（2）交联度：交联度小，交换速度快（3）温度：越高越快（4）离子化合价：化合价越高，交换越快（5）离子大小：越小越快（6）搅拌速度：在一定程度上，越大越快（7）溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速度越快离子交换操作方法：1）树脂预处理2）离子交换吸附3）洗脱离子交换完成后，将树脂吸的物质重新转入溶液的方法洗脱方法：（a）改变溶液pH值（b）改变溶液离子强度（4）再生酸性阳离子树脂酸-碱-酸-缓冲溶液淋洗碱性阴离子树脂碱-酸-碱-缓冲溶液淋洗影响离子交换选择性的因素：（1）水合离子半径：半径越小，亲和力越大2）离子化合价：高价离子易于被吸附（3）溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交换容量；（4）离子强度：越低越好；（5）有机溶剂：不利于吸附；（6）交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少； （7）树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力交联度：树脂的性质与合成时所用交联剂（二乙烯苯）的含量有关.合成树脂时,单体中二乙烯苯的含量百分数称为交联度,通常为8-12二乙烯苯含量越高,交联度越大,树脂就越坚固,机械强度越好,在水中不易膨胀.反之,交联度越小,树脂变得柔软,容易膨胀.四、分子筛凝胶色谱1、概念：在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离2、特点：操作简便；分离效果好，重复性高，回收率高；分离条件温和；应用广泛适用于生物大分子的初级分离，脱盐；分辨率低；五、疏水作用层析1、原理：依据生物大分子疏水性差异实现分离由于不同蛋白质分子氨基酸组成差异，其疏水性也不尽相同，HIC技术是基于生物大分子的疏水性差异而实现分离的。2、具体方法是：在高盐环境下，蛋白质表面的疏水区域暴露，固定相表面修饰了一些疏水的基团，这样蛋白质的疏水部分即可与固定相发生较强的疏水相互作用，从而被结合在固定相表面，而一旦降低流动相的盐浓度即可实现蛋白质的洗脱（见下图），方便易行，是蛋白质分离的常用手段之一。六、亲和色谱蛋白质分离常用的色谱方法1、免疫亲和层析2、疏水层析3、离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段膜的特点不对称性、分离速度快。膜分离的传递机理和推动力可以是多种多样，如浓度差、压力差、电位差、温度差等。膜的种类1•微过滤（micro-filtration,简称MF）优点：滤层厚度不变、滤速恒定缺点：易使大分子物失活、易污染、堵塞、渗漏推动力：压力差，通常为0.1MPa透过物：水和溶解物应用：细菌、细胞碎片、蛋白质等的分离和浓缩2•超滤（ultrafiltration,简称UF）透过物：水和盐推动力：压力差应用：制备酶、激素、核酸、疫苗、病毒、蛋白质等3仮渗透透过物：水推动力：压力差应用：淡化海水、软化水、污水处理等4•电渗析（electro-dialysis）透过物：离子推动力：电位差应用：海水淡化、分离和回收发酵产物5•透析（dialysis透过物：离子、小分子有机化合物（尿素等）推动力：浓度差应用：脱盐、改变溶剂成分、除去或更换小分子物等膜的要求①透过速度快②选择性好③机械强度好④耐酸碱、耐热、化学相容性、生物相容性⑤不易被污染⑥价格低廉、制造容易表征膜的性能参数有孔的性质（包括孔径、孔分布和空隙度）、截留分子量、水通量、抗压能力、pH适用范围等。通量决定于膜表面，在使用时，溶质分子会沉积在膜表面上，使各种膜的通量区别变的不明显。滤膜对溶质的截留能力以截留率b来表示，b=1时，则Cp=0,表示溶质全部被截留；当g0时,则Cp=Cb，表示溶质能自由透过膜。截断分子量相当于一定截留率（通常为90%或95%）的分子量。影响截留率的因素：①溶质分子的大小②分子的形状③吸附作用④其他高分子溶质的影响⑤温度升高，浓度降低，会使截留率降低，由于吸附作用减小的缘故。⑥错流速度增大使截留率降低。用减小的缘故。⑦pH值、离子强度。孔道特征：包括孔径、孔径分布和空隙度，是膜的重要性质。孔径的测定：常用泡点法（Bobble-pointmethod），是膜的重要性质，对微孔滤膜尤其适用膜污染：膜、溶质-相互作用（吸附、沉淀、结晶）〜膜孔堵塞-截断分子量和水通量下降-分离效果差、分离速率降低膜污染是一个不可逆的过程，影响污染的主要因素：（1）膜的特性（亲水性、疏水性、电荷性。亲水性的溶剂应选疏水性的膜；反之，选亲水性的膜。（2）蛋白质的种类及溶液的pH（溶质的电荷性质与膜相同，污染最小。在等电点附近操作，溶质易沉淀，污染严重。）（3）无机盐：（无机盐复合物T沉积T污染在较低pH下，盐类沉积较少）（4）温度（温度升高，粘度下降，透水率增加，污染下降）膜的清洗⑴机械法⑵化学法传递理论一、毛细管流动模型二、溶解—扩散模型三、优先吸附—毛细孔流动模型四、浓差极化——凝胶层模型影响过滤速率的主要因素⑴进料液浓度⑵流速⑶压力⑷温度膜装置基本要求⑴尽可能大的过滤面积⑵为膜提供可靠支撑装置⑶切向流（使浓差极化达最小）⑷透过液的引出⑸保留体积小⑹更新、清洗方便模装置1•板式2•管式（特点：①可用于超滤及反渗透；②结构简单，适应性强；③压力损失小，透过率大；④清洗、安装方便；⑤适于高黏度溶液；⑥单位体积膜面积较小，生产能力低）3•螺旋卷式（受力较好，适合于反渗透，膜面积较大，湍流情况较好，阻力大清洗不方便，不适合于超滤。）4.中空纤维式（特点：1单位容积过滤面积大；2不需要支撑物,造价低；3动力消耗低；4不能处理带颗粒物料；5内流式不宜处理粘稠液；6操作压力W0・5MPa。）细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖。大多数霉菌由几丁质和葡聚糖构成，此外还含有少量蛋白质和脂类。少量低等水生霉菌的细胞壁由纤维素构成。酵母细胞壁的主要成分是葡聚糖、甘露糖、蛋白质和几丁质。藻类的细胞壁的主要结构成分是纤维状的多糖物质。生物分离与纯化特点：（1）目的产物浓度低，纯化难度大（2）活性物质性质不稳定，操作过程容易失活（3）生物材料中生化组分数量大，分离困难（4）生物材料易变质，保存困难（5）生物产品的质量标准高。分离纯化过程设计基本原则：①时间短②温度低③PH适中④厂房设备等要清洁卫生。基因工程产品与传统发酵产品的比较：①分离难度增加②放大困难、操作靠经验③大多为胞内产物，即必须进行细胞破碎④生物安全问题。生物制品分离与纯化的发展方向:①新型分离方法的研究与开发②上游技术与下游技术相结合。生物分离与纯化基本步骤：原料的选取和预处理，分离提取，精制和成品的制作预处理的方法：①粘度的改变：加水稀释、加热②絮凝③调节PH（适用于两性物质，等电点溶解度最小）④加助滤剂（使滤饼疏松，滤速增大）⑤加反应剂（若有硫酸根离子，可加钙离子；若有大分子，可加酶