人外周血淋巴细胞彗星试验检测水体遗传毒性的

人外周血淋巴细胞彗星试验检测水体遗传毒性的研究摘要：应用人外周血淋巴细胞彗星试验对无锡充山水厂、中桥水厂，常州西石桥水厂进出水及金坛市拟用水源地长荡湖湖心水样的遗传毒性进行了研究。结果表明各水样的有机浓集物均可对人外周血淋巴细胞DNA产生不同程度的损伤，存在一定的遗传毒性。试验结果与各水样水质污染状况基本一致。同时，季节变化以及常规水处理过程对水样的遗传毒性有影响。研究表明彗星试验可有效地用于检测水体有机浓集物遗传毒性。关键词：饮用水，遗传毒性，人外周血淋巴细胞，彗星试验GenotoxicityevaluationofwaterinhumanperipheralbloodlymphocytesusingthecometassayAbstract:Thegenotoxicpotentialsoforganicpollutantsinsourceandtapwatersamplesofthreewaterworks（i.e.,Chongshan,ZhongqiaoandXishiqiao）andwatersampleofChangdangLakewereevaluatedwiththecometassay.TheresultsshowedthatDNAdamagesinhumanperipheralbloodlymphocyteswereinducedafterexposuretotheorganicextractsfromallwatersamplesandthegenetichazardexisted.Theconcordancebetweentheresultsofthecometassayandthepollutionconditionsofthewatersourceswasdisplayedwell.Moreover,theresultsindicatedthealternateseasonsandthewatertreatmentprocesscouldaffectthequalityofwater.Theresultsofthisstudydemonstratethatthecometassaycanbesuccessfullyappliedtothegenotoxicitymonitoringprogramofthewater.Keywords:drinkingwater，genotoxicity，humanperipheralbloodlymphocyte，cometassay饮用水与人体健康直接相关。自从70年代初美国环保局首次在水中发现氯的衍生物以来，水中有机物对人体健康的影响已日益引起人们关注。据1995年的数据，全世界已在水中测出有机化合物2221种，其中许多具有致癌、致畸和致突变作用。国内也有相关的报道，研究发现黄浦江水中有机物达700种，而用GC／MS法测得第二松花江吉林江段水中有机物317种，其中不乏致癌、致突变物[1]。因此，有研究认为，对人体健康和人口素质的影响而言，水源中是否含有遗传毒性的物质，应该是估价水源水质的主要指标[2]。由于此类有机物大都呈现低剂量长期暴露的特点，常规的理化分析不足以对水质状况作全面的评价，所以建立一种有效的测试方法评价水中有机物的遗传毒性是环境监测工作中的一项重要任务。对于水体有机物污染的遗传毒性评估，一般都采用体外短期生物测试系统进行，如Ames试验、微核试验、V79细胞致突变试验等。近年来，彗星试验由于其快速、敏感、可靠等诸多优点正越来越多地在这方面得到广泛的应用[3]。本文采用人外周血淋巴细胞彗星试验，对无锡充山水厂、中桥水厂，常州西石桥水厂进出水及金坛市拟用水源地长荡湖湖心水样的遗传毒性进行了研究。1材料和方法1.1试验材料健康人外周肝素抗凝全血，采自南京市中心血库。1.2水样的采集与处理于2003年4月采集无锡充山水厂、中桥水厂进出水，2003年7月和12月分别采集常州西石桥水厂进出水及长荡湖湖心水样。其中，无锡充山水厂、中桥水厂水源地位于太湖梅梁湾，常州西石桥水厂水源地为长江，长荡湖为常州金坛市拟用水源地。各采样点采样量均为20L。水样静置24hr，过滤去除悬浮颗粒，通过XAD-2树脂吸附柱富集，控制流速在30-40mL/min，N2排除水分，以甲醇、丙酮、二氯甲烷洗脱，洗脱液用氮吹仪在50℃条件下浓缩，吹干，再用二甲基亚砜（DMSO）溶解，定容至2.0mL，避光保存于-18℃冰箱中备用。1.3人外周血淋巴细胞的分离与染毒将新鲜肝素抗凝血按血量1/3加入3％的新配明胶溶液于离心管内混匀，立即垂直置于37℃恒温水浴，自然沉降约30min。吸取淡黄色淋巴细胞层0.2mL于事先装有0.8mLPBS缓冲液的微量离心管中，3000rpm离心3min，弃去上清，加入0.9mLPBS及0.1mL水样浓集物，37℃避光染毒1hr。每个水样设三个剂量（即相当于原水样20mL、100mL、500mL/管）。染毒后3000rpm离心3min，弃上清，沉积细胞置4℃冰箱中备用。同时作DMSO溶剂对照。用苔盼蓝染色观察细胞存活率。1.4彗星试验彗星试验方法参照Singh报道[4]。铺好胶层的玻片在冷细胞裂解液裂解1hr后，在碱性电泳液（pH＝13.0）静置，解旋30min。调节电压为25V，电流为100mA，电泳1hr。以上各步骤应在红光或黄光下进行，以免产生额外的DNA损伤。电泳后，经中性缓冲液中和，在24hr内，每张玻片以50µL溴乙锭（EB）染色，荧光显微镜下观察，进行显微摄影。3.2.3结果评价及统计分析采用彗星图像分析软件CometAssaySoftwareProject(CASP)，以彗尾DNA含量（TailDNA%，TD），彗尾长（TailLength，TL）以及Olive尾矩（OliveTailMoment，OTM，即彗尾DNA含量×彗星头尾部密度重心间距离）等三个评价参数对DNA损伤进行定量分析。每玻片至少分析50个细胞。货根据数据的分系布特征和方差半，便以隶Man脖n昏–援Whitne练yU指检验比较掉各剂量组与溶笋剂对照间的损窑伤差异。考虑再到高剂量的染歇毒可能造恒成啦DN胁A负的严重损伤，凝而使大量而的交DN肠A先游离断片在电恋泳过程中丢失父而引起可硬测饲DN叔A晕损伤的降低恒[5]上，而剂量过低蚂可能使组间差膝异难以充分表车现，所以本文挪以里100mL演/病管这一剂量对烧各水样间的遗扭传毒性进行多此重比较。由贞于唇OT捞M增同时反映了彗忆尾唱中茅DN酿A散含量和彗尾形没状特征，所以饶组间的多重比森较吉以河OT鸽M轰为指标，采用绍Krusha队l侨–秧Wallis摘H埋检验法，显著中性水平设吩为统0.0短5寒。胆2际乒结果与分析妥张典型彗星图像淹如远图瘦1燕、洪2疼所示。无锡充被山水厂、中桥预水厂进出水，膨常州西石桥水黑厂进出水及长颤荡湖湖心水样匀有机浓集物对成人外周血淋巴徒细允胞寸DN莲A伞损伤的结果分瓜别见抱表赖1技和滔表哲2晚。村苔盼蓝染色法串的结果表明，昨各水样不同剂围量组染毒前后口细胞存活率均僵>抽9怜0环％，所以引勺起蜡DN谱A栽损伤的主要为多遗传毒性，而惊非细胞毒性。披从灾表浴1照中可以看出，巷与溶剂对照相剩比，除充山水蓄厂和中桥水厂筋出水的低剂量常组潮（计20mL绝/点管）菜在剖T竟D堂这一指标上无造统计差异外，鹅其它各水样浓载集物均有极显友著差优异拉(P<0.0帜1壮)朋，且随着剂量禁的加大，受损滴的程度也加重糠。丈以悟OT羊M项为评价指标，趟在趴100mL堂/郊管这一剂量进伴行比较发现各负水样间无统计吼学差异早（款P>0.05战）扬。图1DMSO溶剂对照组人外周血淋巴彗图1DMSO溶剂对照组人外周血淋巴彗星图像（×400）Fig.1Cometfigureofhumanperipheralbloodlymphocytestreatedwithsolventcontrol(DMSO)（×400）图2充山水厂出水有机浓集物500mL/管剂量组人外周血淋巴彗星图像（×400）Fig.2Cometfigureofhumanperipheralbloodlymphocytestreatedwiththeorganicextracts(500mL/tube)fromtapwaterofChongshanWaterwork（×400）挡表捡1鹿纳无锡充山水厂喂、中桥水厂进殿出水场（国2003转.爆4激）有机浓集物迷对人淋巴细激胞咳DN辰A比的损伤厕Table益1DNA逮damage壮sinhu胳manpe拌ripher范alblo籍odlym湖phocyt比esexp患osedt改oorga漂nicex凤tracts帅from多source忌andt萌apwat亚erofC遣hongsh贵an,Zh惠ongqia以owate窄rworks骆(2003耕.4)柜水样蓝染毒剂量叨（壶ml/详L集）什TailD颗NA誓（％）换Taill嘉ength燃（蒸μ亏m发）炕Olive汽TailM归oment逗充山水厂进水套20融8.65±0乔.62**汗11.51±腾0.76**序1.34±0咸.1裹2赠**打100寸14.63±档1.10**赔18.35±壳1.33**誓3.19±0警.升40兽**离500铺28.23±我1.68**惨35.43±湖2.叔70妹**温8.32±1亩.12**笋充山水厂出水有20队7.93±0航.68屈10.31±糕0.8奉7构**凯1.25±0俊.14**遵100途13.兼60拼±0.81*狼*叠15.36±其0.默90唐**纺2.19±0贤.17**伯500穗22.23±舒1.61**棍26.01±吸2.0兼4会**迈5.41±0毕.69锄1向**静中桥水厂进水此20披8.58±0责.48**小10.25±浸0.55**彼1.27±0助.1萝1旷**歼100厅13.21±难1.07**访19.54±冷1.24**佩2.76±0厦.3刘1铅**盾500昆28.47±帝3.1稳5谦**菌25.26±解2.8疼6驴**阵5.56±0血.70**体中桥水厂出水救20痛7.62±0块.85妙10.79±斜1.20**额1.45±0藏.2灵6苗**只100腐12.63±永1.535*赤*像13.95±稼1.吓20开**往2.06±0圆.宣30故**组500诉18.05±症1.03**弓17.74±稿1.1俯3擦**送3.24±0娇.3边2也**凶溶剂对照吉0荒6.65±0突.39勇7.81±0如.40冻0.86±0微.06辰注丈：继1.全茎数据均配以筝mean±S爱.E.诞M泪表帽示锡;粗2.洪**:索P返<锡0.0原1舱。够从艰表贵2葬中可以看出，拦与溶剂对照相毒比，贿除医7病月西石桥进水捕和唇1凤2别月长荡湖湖心守水样的低剂量燃组脑（劝20mL册/贯管）寇在窑T警D圾这一指标上无丰统计差异外，羡其它各水样浓恳集物均有显著京或极显著差掏异墨(P<0.0绍5致，同P<0.0龟1评)忙，且随着剂量劈的加大，受损思的程度也加重溉。同时，多重刮比较的结果表乘明圾，圈7青月份对人血淋喜巴细所胞弊DN军A饥损伤程度大小惩顺序为长荡湖叨湖心水样、西魄石桥水厂出瞒水呜>仇西石桥水厂进卖水榜，放1踏2积月份长荡湖湖梦心水公样猫>鞋西石桥水厂进醉水杰>燕西石桥水厂出融水挺（忧P<0.05蛛）做。同时，比较糟两次不同时间风的水样可知，掠季节变化变化暑对水质影响显甩著，其墙中闻7邀月份西石桥水挠厂进水对人血败淋巴细赵胞怜DN嫌A肢损伤程度极显竭著台（吴P<0.0旋1虹）小博于导1猾2话月份进水，长社荡湖湖心水遭样锈7块月份显著牢（昌P<0.0咏5怒）小突于杏1翻2奉月份，而西石傻桥水厂出水水垂质灿7旦月份大饲于会1刚2珍月份，但无统奴计学差异。期表狂2冲常州西石桥水使厂进出水、长靠荡湖湖心水样者（料2003.咐7白，音2003.1距2页）朴有机浓集物对科人淋巴细易胞头DN援A公的损伤伶Table杨2DNA床damage表sinh蜘umanp杆eriphe稼ralbl凑oodly响mphocy疏tesex侵posed捞toorg粗anice茂xtract燃sfrom悬sourc彻eand梦tapwa语terof勾Xishi奋qiaow蝶aterwo归rk,an假dwate喊rsamp太leof怠Changd均angLa仍ke(20蠢03.7,燥2003.1缓2)培水样供染毒剂量烂（携mL潜/间管）刊TailD萄NA等（％）械Taill虽ength身（班μ苹m绳）专Olive热TailM欲oment抢７月份企西石桥水厂进谊水牙20缓7.08±0爹.43永11.39±丧0.58**滨1.29±0拔.10**药100系11.48±坚0.63**谅13.89±碑0.71**买1.89±0焦.14**a辟500游15.90±监1.48**腥18.42±院1.83**惯3.01±0熄.53**摆西石桥水厂出葬水哑20娱9.84±0歌.69**呢11.40±弱0.71**陈1.49±0碗.13**时100楚15.88±刮0.99**浮19.53±盐1.18**奏2.83±0液.21**b脆500氧30.81±辈4.坏50渔**纤31.85±埋6.38**斥6.62±1善.49**帖长荡湖湖心水蚀样固20兽8.66±0芝.92*择10.14±是1.16**衫1.25±0廊.15**我100侨16.16±搂1.19**珍18.77±届1.36**觉2.93±0料.28**b逗500少31.79±漆2.84**既30.56±足2.5锋4顺**华7.51±0延.98**继1短2弄月份尘西石桥水厂进虫水纪20粉9.57±0涛.30**件18.33±鲁0.57**土1.78±0纲.07**粘100煮12.19±统0.63**朽22.06±什1.04**育2.80±0年.26**b餐500驰15.38±以0.98**蚕30.33±纱1.80**王4.59±0吹.48**爷西石桥水厂出高水苗20坐7.86±0沙.34*防12.25±筛0.52**洽1.31±0摩.08**诸100逗9.70±0涛.55**勿14.68±系0.81**猎1.95±0执.31**a眠500板16.57±系0.79**编29.95±恒1.57**伴4.26±0侦.36**理长荡湖湖心水栋样丛20汤7.21±0帆.54亏12.32±闪0.77**奶1.50±0俭.16**煎100武16.79±品0.6盐5扣**廉25.25±恢0.96**铸3.92±0俩.26**c揉500让32.26±历1.10**宣46.47±狐1.89**肯10.17±遣0.60**瑞溶剂对照苹0克6.65瓦±钳0.39佣7.81杂±甜0.40铁0.86跨±叠0.06伟注奋：灭1.廊窜数据均受以予mean±S学.E.旁M思表示；舌*萍：恢P血<0.05测，楼**:夕P诸<旨0.01垮2.损纳以蔬100mL闯/矮管进行组间比殃较，相同字母夜表示样本间无煮差异，显著性构水平蛛为抓0.0夹5打；薪以宗100mL嗽/架管这一剂量组毫比较各水厂进暂出水可知，无令锡睛充山水厂和中泻桥水厂进水对棍人淋姓巴细雪胞浑DN针A榜的损伤程度均风高于其出厂水宏，但无统计学梯差异强（挺P咽>汉0.0招5体）；常州西石纹桥水亮厂光1妻2弄月份进水对人浊淋巴细隔胞备DN钉A计的损伤程度高醉于出厂水傲（长P壮<惊0.0户5泊），副而若7诱月份进水低于险出厂水与（猎P挠<脂0.0士5火）。3讨论土长江江苏段衫干流水质总体坟较好，水质符而合地表水环境截质量构II弹类标准。惠无锡充山、中具桥水厂都位于岗太湖北部梅梁析湾执,幻目前该水域的艘生态环境恶化姻已经成为太湖疤最主要的生态聋环境问题，水滔质类别为臂劣简Ⅴ为类。坏长荡湖为太湖摩流域第三大湖折泊，目前水质劫基本满抗足启Ⅲ械类标准，水体扰营养状况为中诊营养，但近年忘来水质也在逐晶渐变差。人淋施巴细胞彗星试学验的结果与以裤上各水样的污扎染状况基本相作符。摄目前，水厂一拐般采用絮凝、舟沉淀、沙滤、叠炭滤和氯消毒董等常规处理工要艺来生产自来搏水氏[6]蜘。研究表明，袄氯化消毒可产剃生多种副产品听，其中不乏具阵有致癌、促癌怒和致突变作用殿的物质，从而秆使出厂水的致框突变性增高悟[7],[仔8]财。马梅等亦[6]甘对不同原水及煤不同水处理工义艺流程出水有唉机浓集物进行晶的致突变试验季表明，加氯处鲜理后可生成一扫些直接致突变增性物质及某些品经代谢转化后想形成的致突变庙性物质，机械河搅拌和絮凝不另太可能改变致礼突变性的状况惹，而在此之后巩的煤砂池和炭掉滤池能够有效慢地去除加氯和俘絮凝过程中生尊成的致突变性诵物质。邱志群异等添[9]返认为，当水源鹿水圣致搅DN远A说损伤物质的本躁底值较高时，仔混凝沉淀对它驳的去除作用更踪为明显，从而漫使出水致突变姑性降低。凳由于无锡市两匹水厂以太湖梅树梁湾（水质相刻对较差）为水虏源水，而常州置西石桥水厂以削长江（水质相断对较好）为水犹源水，同时考奖虑到水质的季膏节变化（统计恳分析表验明耽7机月份进水的致浮突变性并极显著地低统于而1小2抱月份进水踪，恋P<0.01我），所以结果喜与以上报道是辛相符的。霞自静198云8佣年衔Sing锤h颜提出碱性电泳蜡法以来，各国滋对彗星试验的超应用研究几乎亿呈指数式增长换，在遗传毒性真研究、临床应满用堤、事DN拐A纠修复研究、环颈境生物监测、购人群监测等领窑域得到广泛应秧用贼[10]郊。人血淋巴细拾胞是彗星试验呀最常用的生物喉材料之一，应索用也最为广泛私，如人群流行剩病学调查，环允境监测、临床灶应用（如疾病懒诊断、药效评此估、病因与发槐病机理分析等枕）翁[11]扮。壶Rajagu嫂ru救等曾将人血淋女巴彗星试验应嘉用于受污染地北表水的检测，轧表明其在环境扎评价中有良好歉的应用前景范[团1运2]洒。本实验室曾欢利用其评价扬油中市地表水的宪污染状况扎[嫂1邮3]消。本文研究也思证实了其用于即检测水体有机猜浓集物遗传毒案性的可行性。赛然而，由于彗液星试验程序尚属未标准化，限兄制了其在实践晃中的推广应用亭，所以有必要克进一步加强彗暮星试验的方法费学研究。4结论健（枝1器）无锡充山水良厂、中桥水厂饭，常州西石桥沾水厂进出水及绕金坛市长荡湖膛湖心水样的有捎机浓集物均沃可对人外周血满淋巴细树胞失DN英A近产生不同程度词的损伤，存在是一定的遗传毒球性。晋试验结果与各黄水样水质污染洪状况基本一致绕。同时，霉季节变化衔以及常规水处师理过程执对骄水样的遗传毒愁性有影响。远（服2晒）彗星试验可镜有效地应用于脊水中有机物遗锁传毒性的检测输，在环境监测颂中有良好的应副用前景，但有版必要对其进行闯标准化以利于美实践中的推广裳应用。参考文献：先[1]垃朱惠刚王.构水中有机致突旋变物综合评价岭指标探讨你[J].掌上海环境科学浆，涌1995恢,识14茂(颤10酱):知44-49你[2]芝冯霄穗,验陆寿珍珍,嚷撒陈中孚泽.S谁O紧S岩显色法检测黄滤浦江不同江段层水中有机污染峡物的遗传毒性茶[J]前.府复旦学剥报斯(妨自然科学净版向)造,1990,漏29(2倒)情：编198-20登2察[3]纺Rojas摄E塞，添Lopez涌MC刷，篮Valver割deM末.Sing董lecel枣lgel训electr佣ophore雾sisas施say:m艺ethodo虑logya脱ndapp弹licati肠ons揪[J]肆.共JChr裂omatog涉rB,1扁999,72钳2:22咐5席–惩254躲[4]并Singh贪NP,M景cCoyM逮T,Ti峡ceRR逼,罩etal.房Asim捞plete畏chniqu需efor筝quanti察tation裕oflo白wleve朴lsof甚DNAda典magei案nindi跨vidual摸cells刊[J].学ExpCe恳llRes恭,1988塞,175:咬184-19醋1敏[5]框Devaux筹A崖,Peso债nenM,询Monod理G.Al极kaline泳comet链assay礼inra果inbow飞trout鲁hepato条cytes坦[J].T道oxicol恼inVi饭tro,1舅997,11撇:71~79搂[6]灵马梅，尚玮，撇王子健等由.葛饮用水处理流摩程中有机提取艘物的毒性变化锡规律牙[J].歇腔环境科学话,副2001厉,差22混(依l擦):魄49-52滥[7]滩马军避.肌氯化消毒副产哨物的形成及对俗饮用水质的影四响划[J].未礼中国给水排水益,巾1996琴,乖12班(景6矛):栽36-37激[8]千黄君礼话,再李海波晃,门毛宁辽.泼二氧化氯和液晚氯消毒饮用水松致突变性的比粱较谷[J].挤稳环境化学北,骂1998迅:浅17恐(足4忍):381喷-