利用酶动力学拟合在密闭条件下香菇呼吸速率方程及米氏方程

利用酶动力学拟合在密闭条件下香菇呼吸速率方程及米氏方程摘要：本研究对香菇在273K、283K和293K条件下密闭容器中的氧气和二氧化碳随时间浓度变化进行了测定，通过酶动力学原理和利用非线性估计法、多重回归分析分别获得气体成分的变化率曲线和米式方程，从而获得相应参数，求得反映呼吸状态的呼吸熵动态变化规律以及温度影响参数—活化能，这样就可以求出在任意温度、有氧呼吸气体环境条件下果蔬的最大呼吸速率，为气调包装系统设计提供必要依据。关键字：酶动力学原理非线性估计法多重回归法米氏方程呼吸熵活化能香菇Lentinasedodes(Berk)sing，又叫香菌、冬菇，属白蘑（口蘑）科香菇属，为食用菌类蔬菜，在蔬菜中属于呼吸强度较大的一类品种。植物活体的呼吸总方程式为：植物体贮藏环境中氧气以及二氧化碳含量直接影响到植物体的新陈代谢，呼吸速度越快消耗体内的糖分等物质就越多,鲜度下降就越快。植物的有氧呼吸涵盖了一系列的酶催化反应，其中包括葡萄糖酵解到丙酮然后通过三羧酸（TCA）循环获得产物CO2[1]。因此，有效的气调包装能抑制香菇的呼吸速率及新陈代谢作用，延缓衰老达到保鲜的效果。呼吸强度是设计气调包装方案的重要指标参数，影响呼吸强度的因素有许多，如温度、湿度、二氧化碳浓度、氧气浓度和时间等。这些参数将为包装膜透气率的计算和选择提供理论基础。本研究延承了Leeetal.（1991）[2]的三维参数模型—时间（t）、氧气浓度（O2%）和二氧化碳浓度（CO2%）浓度之间的相互关系，建立酶动力学方程即Michaelis-Menten方程，同时考虑三种参数影响，得到香菇呼吸模型，为气调包装参数的选择提供理论基础[3]。1材料与方法1.1材料香菇采购于上海杨浦区渭南路农贸市场，选取菇型圆整、菇柄正中、不开伞，卷边整齐，无病斑的香菇为实验材料，并进行清洗、沥干处理，实验前将香菇在预设的三种温度（293K、283K和273K）下贮藏5个小时直至达到实验所需温度。1.2仪器103层析仪[色谱柱为：Porapak-Q柱（60~80目）+13X（60~80目）：上海仪器厂1.3主要实验方法1.3.1密闭实验设置实验通过初始条件即O2：21%；CO2：0.0%，将一定质量的香菇放于一定体积的玻璃容器中，瓶底装入干燥剂（一定量的硅胶和CaCl2（s））以控制体系湿度，因为湿度会影响到贮藏样品的水分活度，水分活度的大小直接影响到生物体代谢快慢，这就会对体系氧气和二氧化碳的浓度变化有较大影响[4]。其次，将瓶口用橡皮塞和真空封泥密封后（橡皮塞上有一φ8mm的小孔，用φ15mm×5的硅胶垫密封），置于一定的水浴或冰浴中待温度恒定，然后每隔0.5-1.0小时用注射器量取0.5mL气体成分注入层析仪进行检测,平行检测两次，同时记录下O2、CO2对应检测的峰高，计算出对应体系中的百分含量。层析仪中参数设置为载气：99.995%N2；流速15mL/min；柱温：40℃；检测器：TCD，温度：80℃；进样温度：40℃；定量方法：外标法。每组实验的设置见表1：表1香菇呼吸密闭体系环境设置Table1Thedesignofclosedsystemmethodofthreedifferenttemperatures社温度扩（奶K彻）械273责283劳293眨香菇质量室（楚g笔）完180.9胳295粒281.6白容器体积涉（绪L颂）编1滨2余2畏空隙体碧（鹿L荐）音1.22峰0.89干0.75托处理条件壁冰浴丸恒温水浴偿恒温水浴1.3.2密闭容器中的呼吸速率方程的拟定由于各类蔬菜的品种和个体差异较大，呼吸环境中氧气、二氧化碳浓度随时间的变化也千差万别，所以历来文献都没有参照统一的方程来描述气体浓度随时间的变化。依据米氏方程的Lineveaver-burk曲线图可知呼吸化学方程在初始阶段反应速度维持恒定即呈线性，但随着时间的增长，曲线的斜率变化速度减少，反应速度趋向一恒定值，因此，简单的直线方程并不能真正地表达浓度与时间的关系，气体浓度随时间变化的曲线呈弧线形，并无限趋近一定值，将所有的参变量（rO2，rCO2）和应变量（[O2]，[CO2]）同时表示成时间（t）的函数，通过上述推论以及结合STATISTICS软件中的非线形估计法[5]（NonlinearEstimation），选取损失函数（L）值最小（损失函数（L）=（观察值（OBS）-预测值（PRED））2），复相关系数(MultipleR)接近于1的公式作为反映不同温度下香菇在密闭容器中气体浓度与时间的关系式：[1][2]其中，氧气和二氧化碳的浓度（[O2]，[CO2]）以百分数%表示，时间t以小时（hr）计算。因此，根据式[1]、[2]可以得出d[O2]/dt以及d[CO2]/dt：[3][4]币则呼吸速率为铅：[5][6]裤式中谣，医r替—佣呼吸速率（氧女气的消耗率或锋二氧化碳的产歪生率）浩（漠mg/k村g脊﹒杨h春r漫）；沉M辟O2/CO2税—静氧气或二氧化匪碳的摩尔质量映（鞭g/mo态l娇）；灶V嘱—伐空隙体积房，棉L钟；设W呈—观密闭体系中香愁菇的重量盐，鸽g兰；折P罚—文体系压强画（衔P别a调）；仆R活—校理想气体常数拜（唇8.314J斧/mo床l笋﹒存K嘴）；某T帆—趟开氏温度剃（共K页）。芳棋Micha病elis-M住ente赛n帮方程的确张立僵屋依据酶动力学絮呼吸模型旱[4]铸要求体系保持疮有氧呼吸状态困即铜[O卡2惧]>1.5烂%讲或迹[CO喷2物]<20葡%夹才是有效的兆[6]尚，氧气过低或现二氧化碳过高著将导致香菇无幸氧呼吸，则不搞符合米氏规律芹。在本次实验窑中同时测定了盖单位时间内底绣物（氧气）的岸消耗量以及产晌物（二氧化碳站）的生成量。尚其中二氧化碳寻又是化学反应津的非竞争性抑榴制剂，因此，阁依据米氏方程待的非竞争性作种用的速度方程哗为如下公式：[7][8]笼式中矿，应V遇m脏、裕K喝m疗和答K棒i隔—筑调整因子；败V努mi所—贸最大反应速率歉（氧气消耗的优最大速率或二皮氧化碳产生的愈最大速率）班（唉mg/k读g轰﹒废h猜r夸）；划K躁mi泉—嫁表观米氏常数怕（错%朋）；龄K系i削—符抑制系数泳（弱%缴）。绳通过实验所测取结果利木用头STATIS始TIC吵A成软件进行多重悲线性回归分析咬求得其值。再而痰r吵CO2/透r泼O2玻的值就是呼吸俩熵刃（怀R百Q蕉）漫[7]脚，它是表现氧液气与二氧化碳耀共同作用下香偿菇呼吸状态的裤动态因子，也版是定性代谢途受径以及表征脱惊羧酶或氧合酶药系统的一个有帮效参数。本次餐实验中要求体绍系维持在有氧邻呼吸状态，所摧以通过计算浴，边R痰Q厉应该小于或接悦近系于丘1福，李即怜r压CO2漠≤美r盘O2倒。税离阻温度对香菇呼部吸作用的影昨响渡绑氧气和二氧化作碳的变化率除匆了受浓度、酶脂等因素的影响啊，最关键的是革受到温度的影席响，在求得了课不同温度下氧喊气和二氧化碳膛的最大变化率宜（薪V透m怕）后，通地过旷Arrhen稻ius融[8]妙关系叶将州1/润T俗与折LnV倘m暗进行线性回归棵，其斜率值送为坡Ea/则R刘，卸E衫a怕（计kJ/mo刚l或）就是活化能零，由此可推算宗其他温度下香窜菇呼吸作用的保最大呼吸速率冶，其预测方程至为：[9]蛛式中部，厅V用m0璃—拴已知的氧气最济大消耗率或二衬氧化碳的最大句产出率骨（你mg/k奶g泪﹒苏h粉r船）；茅T腥0宵—昆已知的温度址（左K按）；艳V贪m堤—单T经温度下的氧气抽最大消耗率或谁二氧化碳的最请大产出率贼（肯mg/k句g来﹒寺h翼r龟）。2结果与分析暮2.1抢盐不同温度下香纷菇在密闭体系常中气体浓度函陈数的确定起各个温度下的犬氧气和二氧化贝碳随时间的变榨化的回归方程李见工表您2延。愚由等表淡2昏可以看出由实天验数据拟合出镰的曲线有较好诚的吻合性，从黎而得出各个温纹度下以时间为温自变量，氧气岂与二氧化碳浓灶度为应变量的仙方程式。斥表挨2责产氧气、二氧化上碳浓度随时间幼变化的非线性肠回归方程民Table询2Nonl弱inear仗estima反tionr狠egress博ionof辞O定2照,CO舱2宴change翅with惹time矛温徐度浓K戴非线性回归估好计方程蒙损失函数描（流Los邮s膊）介复相关系数涂（免Multip院le遥R宵）凯293新9.77摩0.993装3.56君0.988陈283肢9.60傅0.987欣6.37贡0.993艇273旬10.89崭0.987芳5.21香0.963吊2.2Mi承chaeli栋s-Ment载e间n贝方程及各参数壶的确立相在求得了各个竟温度下氧气和覆二氧化碳浓度衫与时间的拟合忆方程后，就可欣以根据公姥式奸[5]~[8朝]求，求得氧气的练呼吸消耗速远率卫r暗O2团和二氧化碳的缓呼吸生成速解率伤r劝CO2连，拟合曲线见莲图幅1吐；根据公俯式仇[7特]枣、再[8乳]仇通过多重线性河回归分析，获然得嗽表描3纺结果：景表台3情态香菇注在脂273舰K娇、艘283挨K米和住293朵K享下根据多重回银归求得米氏方请程各参数值挂Table于3Estim挽atedv泰alues泡forMi坊cheali遇s-Ment籍enmod宏elof驻shiita梳kein轨273K,2底83Kan葬d293K迈deter象minedb欣ymult返iplel近inear圾regres港sion炸温度

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