考马斯亮蓝法测定（试验报告）

本文格式为Word版，下载可任意编辑——考马斯亮蓝法测定（试验报告）考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量

吴凡郭梦雨

摘要:本试验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光

度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH值、外源添加物对果肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法，以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。结果说明：外源添加PVP和EDTA以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。试验最终确定的提取条件为0.1mol/LpH9.0Tris-HCl提取缓冲液(内含1mmol/LEDTA和1%PVP),此条件下苹果果实可溶性蛋白的有效测定含量为34.93%。

（其中，1-11分别代表水、pH为7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0的Tris-HCl缓冲溶液（100mmol/L））

不同缓冲体系对可溶性蛋白提取效果的影响寻常利用考马斯亮蓝G-250染色法测定植物组织微量的可溶性蛋白时，常选用的提取液包括水、Tris-HCl缓冲液和磷酸（PBS）缓冲液。本试验研究了水以及不同pH值的Tris-HCl缓冲液定苹果组织低量可溶性蛋白质的提取影响。在Tris-HCl缓冲溶液（100mmol/L）有效缓

溶液及PH值水PH=7.2吸光度A蛋白含量μg蛋白含量%0.12919.1915.350.15123.2918.63PH=7.40.1823.1118.49PH=7.60.16325.5320.42PH=7.80.16626.0920.87PH=8.00.16024.9719.98PH=8.20.17227.2021.76PH=8.40.18629.8123.85PH=8.60.20132.6126.09PH=8.80.21835.7828.62PH=9.00.25843.2334.58冲范围内(7.0-9.2)选取如下pH值梯度：7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0。采取1:5料液比制备可溶性蛋白质提取液，按制作标准曲线方法测定提取液可溶性蛋白含量，测定结果如下图。由图可以看出：随Tris-HCl缓冲溶液

pH值的升高，可溶性蛋白质的提取效率增加；且Tris-HCl缓冲溶液提取效果明显优于水提组，其中pH7.2的Tris-HCl缓冲溶提取效率最低，但提取的可溶性蛋白含量依旧比水提组高17.55%；提取缓冲液pH值为9.0时提取效率最高，比水提组和提取组pH值为7.2分别高125.27%、85.61%。查阅文献得，整体上Tris-HCl缓冲溶液提取效率高于磷酸盐（PBS）缓冲溶液苹果果肉组织可溶性蛋白质提取的适合缓冲溶液为pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液。

2.2.2不同缓冲液浓度对可溶性蛋白质提取效果的影响

表四不同浓度Tris-HCl对可溶性蛋白质提取效果的影响

溶液mmol/L吸光度A蛋白含量μg蛋白含量%

00.12919.1915.35100.14922.9218.34300.16626.0920.87500.19631.6825.34800.23839.5031.601000.26447.3337.86

（其中，1-6分别表示浓度为0、10、30、50、80、100mmol/L的pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液）

常用可溶性蛋白质提取缓冲液浓度为0.02～0.05mol/L缓冲体系，试验过程

中，选择0.01、0.03、0.05、0.08、0.1mol/L的pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液进行试验，结果如下图。由图可知，低浓度pH为9.0的Tris-HCl缓冲条件即可明显提高可溶性蛋白的提取效率(如10mmol/L缓冲溶液可溶性蛋白提取量比对照水提组高19.48%)。且随着Tris-HCl缓冲液浓度增加，可溶性蛋白的提取效率增加。30、50、80、100mmol/L缓冲溶液可溶性蛋白提取量分别比对照高35.96%、65.08%、105.86%、146.64%。其中，100mmol/L缓冲液提取效果最正确，其可溶性蛋白有效提取量比80mmol/L缓冲液仍高出19.81%。

2.2.3外源添加物对可溶性蛋白提取效果的影响

以上述试验确定的100mmol/L，pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液为基础提取液，添加蛋白酶保护剂和抑制剂，进一步探讨外源添加这些物质对真实测定果蔬组织中可溶性蛋白质的含量的影响。分别选取抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巯基乙醇、NaCl、MgCl2以及这些试剂的不同组合进行试验，以不添加任何添加物的100mmol/L，pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液为对照，结果如下图所示。

表五不同外源添加物对可溶性蛋白质提取效果的影响

外源添加物抗坏半胱血酸氨酸EDTAPVPβ-巯基乙醇NaClMgCl2PVP＋β-巯基乙醇PVP＋EDTAEDTA＋PVP＋β-巯基乙醇无吸光度A蛋白含量μg蛋白含量%

0.2150.24335.2240.4328.1832.340.32655.9044.720.35461.1248.900.17327.3921.910.16325.5220.420.18028.6922.950.19130.7424.590.38366.5253.210.20132.6126.090.26143.4434.75

（其中，A-J分别代表抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巯基乙醇、NaCl、MgCl2、PVP＋β-巯基乙醇、PVP＋EDTA、EDTA＋PVP＋β-巯基乙醇）

单独添加2mmol/L半胱氨酸对可溶性蛋白提取效果无明显影响；单独添加2mmol/L抗坏血酸、0.15mmol/LNaCl、2%β-巯基乙醇和0.15mmol/LMgCl2对该浓度和pH值的缓冲液可溶性蛋白的提取效率均有抑制作用，这4种物质处理后，可溶性蛋白提取量分别比对照组低23.31%、70.17%、58.60%、51.41%。从β-巯基乙醇和PVP及EDTA的复合处理结果也可看出其对果实可溶性蛋白提取的抑制作用，PVP＋β-巯基乙醇处理组可溶性蛋白测定量比PVP处理组低，PVP＋EDTA＋β-巯基乙醇处理组可溶性蛋白含量比PVP＋EDTA组低；单独添加PVP和EDTA均有助于提高果实可溶性蛋白的提取率，PVP效果(比对照高40.71%)好于EDTA(比对照组高28.69%)。而PVP和EDTA复合处理效果比单独处理效果更佳，其有效可溶性蛋白提取量比对照高53.12%。

2.3苹果组织可溶性蛋白质含量的测定

表六苹果组织可溶性蛋白质含量的测定

次数吸光度蛋白含量μ蛋白含平均值

123项目0.2600.2630.258g43.6044.1643.23量%34.8835.3334.5834.93上述研究结果说明，以考马斯亮蓝G-250染色法测定组织微量蛋白含量时，果实可溶性蛋白提取受提取液pH值、缓冲盐种类、缓冲盐浓度、外源添加物PVP和