分子荧光光度法测定二氯荧光素1

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试验目的

(1)把握荧光分析基本原理及荧光素。(2)学会使用荧光分光光度计。试验原理

荧光是光致发光。当物质分子吸收光，从基态跃迁到激发态，成为激发态分子，处于激发态的分子通过无辐射去活（释放能量），回到第一电子激发态的最低振动能级，再以发射辐射的形式去活，跃迁返回基态的各个振动能级而发出荧光。

有苯环或有多个共扼双键体系以及具有刚性平面结构的有机物分子易产生荧光；无机盐金属离子不产生荧光；而一些金属螯合物合物能产生很强的荧光。取代基的性质、溶剂的极性、体系的pH和温度都会影响荧光体的荧光特性或荧光强度。

(1）荧光光谱定量分析原理

溶液的荧光强度F与该溶液对光吸收的程度、溶液中荧光物质的荧光效率及浓度有关：F=2.303ΦI0kbc

式中，Φ为荧光效率，为发射的光子数与吸收的光子数之比；I。为激发光强度；k为摩尔吸收系数；b为光程长度；c为荧光物质浓度。当发光强度一定时，F=Kc。

只有在c较小时上式才适用。即在低浓度时，荧光强度F与溶液荧光物质的浓度c成正比。

(2）激发光谱

固定荧光最大发射波长，改变激发光波长，测得荧光强度与激发光波长的关系曲线即为激发光谱曲线。由激发光谱曲线可选出最大激发波长。

(3）荧光光谱

固定最大激发波长，测定不同发射波长时的荧光强度，即得到荧光光谱曲线。由荧光光谱曲线可选出最大发射波长。

激发光谱与荧光光谱有镜像关系。

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荧光素能产生较高的荧光效率（约0.85)，在低浓度时产生强的荧光，在pH=5~10范围内，荧光与溶液pH值有关。在0.lmol·L-1NaOH溶液中，可保证其恒定的荧光效率。

仪器和试剂

（1）仪器FLUORAT-02-PANORAMAN荧光分光光度计(俄罗斯刘梅斯公司)；100mL容量瓶，10mL、5mL、2mL、1mL吸量管。（2）试剂

①100.0μg·mL-1二氯荧光素标准储存液：确凿称取0.0100g二氯荧光素（A.R），参与1mol·L-1NaOH5mL，再加3mL1moL·L-1HCl溶解后，用二次蒸馏水定容至100ml；取0.5ml上述溶液，转移至100ml容量瓶中稀释至刻度，配成0.50μg·mL-1标准溶液供配制标准系列用。②1mol·L-1NaOH溶液③1moL·L-1HCl溶液④待测试样溶液。四、试验步骤

1、系列标准溶液的配制分别吸取0.50μg·mL-1二氯荧光素标准储存液0.0,2.0mL,4.0mL,6.0mL,8.0mL和10.0mL放入6个100mL容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀，备用。

2、制激发光谱和荧光发射光谱发射和激发狭缝宽度均为5nm，扫描速度500nm/min，选用激发光波长484nm，荧光波长510nm，在荧光分光光度计上记录485～620nm的荧光光谱和400～600nm的荧光激发光谱。

3、定标准曲线将激发波长固定在484nm，荧光发射波长固定在510nm，测量系列标准溶液的荧光强度。

4、标准系列溶液同样的条件下，测量试样溶液的荧光发射强度。

5、标准系列溶液的荧光强度及对应的浓度绘制If~C曲线，并以试样的荧光强度在标准曲线上查出相应的含量。

五、问题探讨

1、试说明分子荧光法的基本原理及影响因素。2、如何绘制