医学硕士答辩欧琴答辩课件

EBVLMP2B细胞表位的预测、克隆、表达及其融合蛋白免疫原性的初步研究答辩人：欧琴导师：张丽芳教授夏克栋教授专业：病原生物学2007.5.17主要内容◆

研究背景◆研究目的◆研究方案◆结果◆分析与讨论◆结论研究背景

EB病毒(Epstein-Barrvirua,EBV)属于γ疱疹病毒科。引起的主要疾病包括传染性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞增多症(PTLD)、霍奇金病、Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌(NPC)。研究背景

LMP2不是转化基因，维持EBV潜伏感染。

LMP2成为NPC等EBV相关肿瘤治疗的理想靶抗原之一。研究背景表位疫苗是目前研制感染性疾病与恶性肿瘤疫苗的方向。多表位疫苗能选择性诱导多价、多特异性应答和控制免疫应答类型。研究背景NPC患者血清中能检测LMP2抗体。B细胞表位的研究为单克隆抗体的制备提供更充分的依据，以B细胞表位为基础的多肽抗原可用于血清学检测。

研究方案一、EBVLMP2的二级结构分析和B细胞表位预测研究方案采用EXPASY服务器提供的SwissProt蛋白质数据库检索LMP2完整蛋白质的氨基酸序列();采用EXPASY服务器提供的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法预测LMP2二级结构()；采用EXPASY服务器提供的SOSUI方法预测LMP2跨膜区域()；采用EXPASY服务器提供的Hopp&Woods、Emini、Jameson-Wolf、Zimmerman方法预测LMP2的亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数()；对上述方法预测的结果进行综合分析，推断LMP2的B细胞表位，并用吴玉章等建立的抗原性指数(AI)综合评判EBVLMP2的B细胞优势表位。◆◆◆◆◆研究方案二、EBVLMP2B细胞表位的克隆、表达及其融合蛋白的纯化研究方案引物碱基序列酶切位点OZLF-675’TCGAGTTACAGCAGGCTGTTAABamHIAGGGCGGATCTTCGATGCGG3’OZLF-685’GATCCCGCATCGAAGATCCGCCXhoICTTTAACAGCCTGCTGTAAC3’OZLF-695’TCGAGTTAAGTGAGATTTAAGGTG3’BamHIOZLF-705’GATCCACCTTAAATCTCACTTAAC3’XhoIOZLF-715’TCGAGTTAATTCGGGATAAATTCBamHITGTGCTGGACAATGATTTG3’OZLF-725’GATCCAAATCATTGTCCAGCACAXhoIGAATTTATCCCGAATTAAC3’图1pET32a/B细胞表位的重组质粒图研究方案研究方案层析纯化蛋白：灌胶BufferB液调节吸光度和透光度样本处理样本加入层析柱中，收集滤液BufferB液洗涤，至A＜0.01，收集滤液BufferD液洗涤，至A＜0.01，收集滤液BufferE液洗涤，至A＜0.01，收集滤液样本收集SDS分析滤液中目的蛋白分布情况BufferB:8M尿素(pH8.0)BufferD:8M尿素(pH6.8)BufferE:8M尿素(pH4.0)研究方案动物：ICR小鼠免疫方式：背部皮下多点注射采血方式：眶静脉采血，3只/组表2动物实验设计组别数量(只)蛋白剂量(ug/只)注射时间取血时间

Ⅰ9ozlf-67500、2、3W2、3、6WⅡ9ozlf-69500、2、3W2、3、6WⅢ9ozlf-71500、2、3W2、3、6WⅣ9Ｈis蛋白500、2、3W2、3、6WⅤ9PBS0、2、3W2、3、6W研究方案ELISA检测：以纯化的融合蛋白作包被抗原以B95.8细胞作包被抗原选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，检测NPC组、CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体结果一、EBVLMP2的二级结构分析和B细胞表位预测结果aa144～150202～208265～268318～322375～390445～455

图2按SOSUI程序预测EBVLMP2蛋白跨膜区膜内区域跨膜区膜外区域结果图3各种不同参数对EBVLMP2的预测结果a.亲水性参数b.极性参数c.柔韧性参数d.表面可及性e.抗原性

二级结构10～82,89～108,116～126,142～149,198～206,288～295,317～321,339～348,379～389,414～422,481～497

膜外区域

144～150,202～208,265～268,318～322,375～390,445～455

亲水性

15～26,36～41,43～60,65～74,90～96,101～119,176～179,199～205,236～242,414～416,483～492

表面可及性13～18,20～22,25～32,39～64,67～82,90～92,95～112,114～116,73～178

199～201,203～204,235～240,378～380,383～384,416～420,484～496

抗原性10～83,88～109,111～121,174～179,198～207,235～241,290～293,340～348,380～387,413～421,471～476,483～491

极性

20～23,45～55,57～59,65～74,90～94,102～117,198～203,234～342,483～491

柔韧性

10～85,89～121,199～205,218～222,236～244,289～296,342～347,370

～378,381～383,385～388,412～420,483～493预测方法预测结果结果表3应用不同方法预测EBVLMP2蛋白B细胞表位的肽段位置二、EBVLMP2B细胞表位的克隆、表达及其融合蛋白的纯化结果结果图4重组质粒pET32a/ozlf-67酶切鉴定1:λDNA/HindⅢDNAMarker;2.pET32a/ozlf-67;3:pET32a/ozlf-67/EcoRI;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoRI图5重组质粒pET32a/ozlf-69酶切鉴定1:λDNA/HindⅢDNAMarker;2.pET32a/ozlf-69;3:pET32a/ozlf-69/EcoRI;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoRI图6重组质粒pET32a/ozlf-71酶切鉴定1:λDNA/HindⅢDNAMarker;2.pET32a/ozlf-71;3:pET32a/ozlf-71/EcoRI;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoRI重组质粒酶切鉴定结果ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71融合蛋白和His蛋白的纯化图9纯化的ozlf-67蛋白SDS电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3：BufferB液滤液；4：BufferC液滤液；5-7：BufferE液滤液图10纯化的ozlf-69蛋白SDS电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3：BufferB液滤液；4：BufferC液滤液；5-8：BufferE液滤液图11纯化的ozlf-71蛋白SDS电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3：BufferB液滤液；4：BufferC液滤液；5-6：BufferE液滤液图12纯化的His蛋白SDS电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3：BufferB液滤液；4：BufferC液滤液；5：BufferE液滤液结果结果三、EBVLMP2B细胞表位融合蛋白免疫原性的初步研究结果图13不同免疫原在不同时间的抗体均值（X±SD）

分别包被3种表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69和ozlf-71，分别检测3种表位融合蛋白的免疫血清与His蛋白免疫血清的抗体效价差异。

结果图14多肽表位诱导鼠免疫血清的抗体效价的ELISA检测结果**：与His蛋白免疫组比较**结果

B95.8细胞作为包被抗原，ELISA检测3种表位融合蛋白免疫小鼠制备的鼠血清抗体效价。

图15B95.8细胞包被ELISA检测鼠免疫血清抗体效价*

：与His蛋白免疫组比较***结果

选用Ozlf-67融合蛋白为诊断抗原，ELISA检测NPC组、CA疾病对照组及健康对照组血清特异性IgG抗体。图16ozlf-67蛋白包被ELISA检测病人血清抗体效价*：与正常组比较*结果分组份数A值阳性阴性阳性率NPC组480.866±0.231

341370.8％CA组680.140±0.1064645.9％正常组680.184±0.0670680表5ozlf-67蛋白包被ELISA检测病人血清抗体阳性率**与正常组比较*分析与讨论预测的B细胞表位是线性B细胞表位，主要的参数有二级结构、跨膜区、亲水性、表面可及性、抗原性以及柔韧性等，抗原性和亲水性是形成表位的首要条件，因而优势表位的形成是多种因素综合作用的结果。分析与讨论采用分子生物学方法分别得到了包含预测表位片段的重组质粒，并得到了融合蛋白，为进一步表位融合蛋白的免疫学检测奠定基础。分析与讨论3种表位融合蛋白均具有良好的免疫原性B细胞表位多肽均能诱导产生特异性抗体以B95.8细胞作为抗原包被酶标板，B细胞表位融合蛋白诱导的小鼠免疫血清与EBV抗原特异性结合，但抗体效价较低，可能是由于单个表位肽的结合能力较弱。分析与讨论

选用Ozlf67融合蛋白为诊断抗原，ELISA检测NPC患者血清特异性抗体，用于NPC的血清学诊断