第五细胞融合与单克隆技术演示文稿

第五细胞融合与单克隆技术演示文稿现在是1页\一共有101页\编辑于星期四（优选）第五细胞融合与单克隆技术现在是2页\一共有101页\编辑于星期四细胞融合实际上包含多个过程：首先是两个亲本细胞并列，以后膜组织局部破坏，最终形成包围融合细胞的连续胞膜。融合细胞表现的特征性变化，有膜成分和胞质成分的交流以及细胞内电导率的连续性。现在是3页\一共有101页\编辑于星期四细胞在融合过程中会发生下列主要变化：

呈致密状态的体细胞在促融合剂的作用下，细胞膜的性质发生变化；首先，出现细胞凝集现象；然后，部分凝集细胞之间的膜发生粘连；继而，融合形成多核细胞；

在培养过程中多核细胞又进行核的融合而成为单核的杂种细胞，而那些不能形成单核的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。现在是4页\一共有101页\编辑于星期四

由于体外培养的细胞很少会发生自发融合（融合频率大约在10-4~10-6之间），因此要采用生物、化学或物理的方法人为地促使细胞融合。现在是5页\一共有101页\编辑于星期四现在是6页\一共有101页\编辑于星期四显微镜下细胞融合过程现在是7页\一共有101页\编辑于星期四融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解现在是8页\一共有101页\编辑于星期四（二）、细胞融合研究进展Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。现在是9页\一共有101页\编辑于星期四Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代出现了电融合技术。现在是10页\一共有101页\编辑于星期四几种细胞融合成功的例子生物种类细胞来源成功年代烟草两个种间苷蓝——青菜大豆——马唐草矮牵牛——龙面花大麦——花生大麦——大豆小麦——矮牵牛油菜——大豆玉米——大豆大豆——野豌豆大麦——蚕豆大豆——草香木犀酵母菌——鸡大豆——烟草大豆——秋水仙人——胡萝卜番茄——马铃薯人——小鼠叶——叶叶——根愈伤组织——叶叶——花瓣种子——种子叶——悬浮细胞叶——花瓣叶——悬浮细胞叶——悬浮细胞悬浮细胞——悬浮细胞叶——根悬浮细胞——叶原生质体——血红细胞悬浮细胞——叶悬浮细胞——叶腹水癌细胞——原生质体叶——根尖纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972现在是11页\一共有101页\编辑于星期四植物融合细胞成长状态对比:右瓶为地面融合的细胞;左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞

现在是12页\一共有101页\编辑于星期四动物细胞融合实验使用的小白鼠现在是13页\一共有101页\编辑于星期四（三）、动植物细胞的融合过程现在是14页\一共有101页\编辑于星期四（四）、细胞融合的意义理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。现在是15页\一共有101页\编辑于星期四二、单克隆抗体技术主要组织相容性复合体现在是16页\一共有101页\编辑于星期四（一）、何谓单克隆抗体？Ig分子的基本结构：由四肽链组成的，二条相同的分子量较小的轻链（L链）+二条相同的分子量较大的重链（H链）组成的。L链与H链是由二硫键连接形成一个四肽链分子，称为Ig分子的单体的基本结构。现在是17页\一共有101页\编辑于星期四抗体的主要类型与结构：抗体由四条蛋白质长短链所组成（两长两短）抗体分子上有两个抗原结合区（二者相同）抗体与抗原结合是专一性的（lock&key）是单一抗体分子，另有IgA（二元体）及IgM（五元体）现在是18页\一共有101页\编辑于星期四▶

IgG由4条多肽组成(两条轻链和两条重键)，通过二硫键和非共价键相连，其分子结构如“Y”型。一端为抗原结合端(氨基端)——可变区(V区)，即氨基酸顺序随免疫的抗原不同而异，有两个相同的能与抗原结合的部位。另一端(羧基端)氨基酸顺序排列比较恒定——恒定区(C区)，可与具有Fc受体的细胞相结合(如巨噬细胞、K细胞、肥大细胞等)，分别产生不同的效应。现在是19页\一共有101页\编辑于星期四IgG抗体结构模型

（红色部分为CDR区域）现在是20页\一共有101页\编辑于星期四一个抗原分子上通常含有数个抗原决定簇每个决定簇至少都可诱生出一种专一性抗体蛋白质性抗原决定簇含有六个以上氨基酸抗原决定簇抗原分子上可以诱导出抗体的部位或片段，称之为

抗原决定簇(antigenicdeterminant)或表位

(epitope)。现在是21页\一共有101页\编辑于星期四存在于抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位（epitope）。抗原决定簇的大小相当于相应抗体的抗原结合部位，一般由5～8个氨基酸、单糖或核苷酸残基组成。现在是22页\一共有101页\编辑于星期四抗体与抗原的特异性结合现在是23页\一共有101页\编辑于星期四

克隆定义只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。由同一抗原诱导而产生的针对多个抗原决定簇的抗体称为多克隆抗体。现在是24页\一共有101页\编辑于星期四

单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myelomacell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridomacell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridomatechnology）。（二）单克隆抗体技术的原理现在是25页\一共有101页\编辑于星期四（二）单克隆抗体技术的原理现在是26页\一共有101页\编辑于星期四NielsK.Jerne

尼尔斯·杰尼

G.Kohler乔治·J·F·科勒C.Milstein塞萨·米尔斯坦1984年10月15日，三位免疫学家被授予1984年度的诺贝尔医学与生理学奖。杰尼是丹麦免疫学界伟大的理论家,他提出了三大理论:抗体形成的自然选择学说、抗体多样性的发生学说、免疫系统的网络学说,开创了免疫学的新纪元,为现代免疫学的建立奠定了基础,杰尼也被誉为“现代免疫学之父”。科勒是德国免疫学家,米尔斯坦是英国分子生物学家,两人的突出贡献是用杂交瘤技术生成了单克隆抗体,并阐明了单克隆抗体技术的原理。现在是27页\一共有101页\编辑于星期四几个关键问题现在是28页\一共有101页\编辑于星期四1.HAT选择原理（酶缺陷型）HAT系统为次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)的缩写。它是根据嘌呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂种细胞特殊的培养基。现在是29页\一共有101页\编辑于星期四细胞内核苷酸的生物合成有两条途径：一条是主要途径，该途径中叶酸及其衍生物是必不可少的，氨基喋呤可抑制二氢叶酸还原酶活性，从而阻断细胞中DNA的合成；另外一条是补救途径，该途径需要两种酶参与。一种是HGPRT酶(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，另一种酶是TK酶(胸腺嘧啶核苷激酶)

。它们可以分别利用次黄嘌呤催化产生的肌苷酸及胸腺嘧啶核苷催化产生的脱氧胸苷来合成DNA。H、T为应急途径时提供外源核苷酸“前体”。现在是30页\一共有101页\编辑于星期四核酸合成的主要合成：由核糖与磷酸合成5-磷酸核糖(R-5-P)，在磷酸核糖焦磷酸酶的催化下，与ATP发生作用生成1-焦磷酸-5-磷酸核糖(PRPP)，以后PRPP再经过一系列反应而生成次黄嘌呤核苷酸(IMP)。现在是31页\一共有101页\编辑于星期四▶在氨基喋呤存在时，阻断了核苷酸的从头合成IMP的途径，细胞只能通过HGPRT使次黄嘌呤酸化形成次黄苷酸，再依次转化为AMP及GMP，即通过“补救途径”依赖外源来合成核苷酸。因此，一个HGPRT－或TK－的细胞株不可能在含HAT的培养液中生长。但这样的细胞与能提供HGPRT或TK酶的细胞融合后，杂交细胞能在含HAT培养液中存活下来。现在是32页\一共有101页\编辑于星期四1.HAT选择原理现在是33页\一共有101页\编辑于星期四▶如果融合细胞的亲本之一是一个能在体外长期生存的骨髓瘤细胞系，而另一个亲本细胞是体外增殖能力有限的正常细胞。如将长期培养系突变为HGPRT或TK酶缺陷型的细胞系，在和正常细胞融合后，未经融合或自身融合的骨髓瘤细胞在HAT培养液中死亡；未融合或自身融合的正常细胞在体外生存能力有限最终也死亡。存活下来的只有融合细胞。现在是34页\一共有101页\编辑于星期四2.骨髓瘤细胞的选择▶每一个B细胞只分泌产生一种抗体，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定簇反应，其专一性极高。大量培养此细胞株，即可有质量一定、纯度均一的抗体，此即为单克隆抗体。但B细胞在体外增殖能力非常弱或不增殖，故无法获得大量的单克隆抗体。现在是35页\一共有101页\编辑于星期四▶骨髓瘤细胞易在培养基中生长；利用细胞融合法将骨髓瘤细胞永久生长的特性导入可生产有用抗体的B细胞中，则得到可在培养基中永久生长的B细胞株，此即杂交瘤细胞株。得到的杂交瘤细胞既具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力，又具有肿瘤细胞在体外无限增殖的特点，可不断在细胞培养上清液中产生单抗。次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）或者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）。现在是36页\一共有101页\编辑于星期四癌细胞可培养生长浆细胞单克隆抗体可产生有用抗体的淋巴细胞若与癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。细胞融合融合瘤两组染色体混合在一起也可培养生长现在是37页\一共有101页\编辑于星期四多用BALB/C小鼠的骨髓瘤细胞。现在是38页\一共有101页\编辑于星期四（三）.细胞材料的准备（1）培养基：制备单抗的培养基常用DMEM（小鼠）和RPMI-1640（人）两种；使用前添加胎牛血清或小牛血清、抗生素、谷氨酰胺等。（2）血清：胎牛血清（球蛋白少）；优质血清可支持接种量小于20个细胞/孔的细胞生长。（3）抗生素：青链霉素+庆大霉素+卡拉霉素预防细菌污染；两性霉素+制霉菌素预防霉菌污染；小鼠体内接种清除支原体。现在是39页\一共有101页\编辑于星期四（四）免疫动物▶1.动物选择

目的：是希望B细胞在抗原刺激下分化增殖，使之有利于融合成杂交瘤细胞，尤其是能分泌特异性抗体的杂交瘤融合细胞频率增加。▶动物选择应与骨髓瘤细胞来源相同的同一品系动物，多为BALB/c小鼠。现在是40页\一共有101页\编辑于星期四▶2.抗原与载体

抗原可分为可溶性抗原（蛋白质、核酸、多糖、多肽等）和颗粒性抗原（细胞、病毒、细菌等）。一般颗粒性抗原都有较强的抗原性，免疫时可不加佐剂；而可溶性抗原免疫时需加佐剂。初次免疫时一般用完全弗氏佐剂将抗原制成乳剂，而以后加强免疫时一般用不完全弗氏佐剂制成乳剂进行免疫。现在是41页\一共有101页\编辑于星期四▶3.免疫途径不同抗原可经不同途径进行免疫，主要有腹腔注射、皮下淋巴样器官注射、静脉注射、脾内免疫等，最常用的途径是腹腔注射。现在是42页\一共有101页\编辑于星期四▶a.腹腔注射：几乎适合于所有抗原体，特别适合于颗粒性抗原，经腹腔注射免疫时还可使用佐剂。▶b.皮下淋巴样器官注射：多适用于可溶性抗原，多点注射有利于提高免疫效果。▶c.静脉注射：不宜用于大颗粒性抗原，不宜作为初次免疫途径，也不宜加入佐剂，以免引起血栓或过敏反应。▶d.脾内免疫：适于抗原量特别少的情况下使用，但脾内免疫多不产生明显的血清抗体，对免疫效果的判断有一定影响。现在是43页\一共有101页\编辑于星期四（五）亲本细胞的准备▶1.脾细胞的分离:

一般动物需经多次加强免疫后才能获得大量的分泌抗体的B细胞。在末次免疫后3～5天左右即可取脾脏或淋巴结细胞分离淋巴细胞(大多为B细胞)用于与骨髓癌细胞进行细胞融合。▶分离脾细胞可用脾内注射培养基轻轻挤压使淋巴细胞逸出的方法，也可用不锈钢网挤压法分离淋巴细胞。现在是44页\一共有101页\编辑于星期四▶2.特异性抗原的富集分离的脾细胞中含有对抗原具有特异性的B细胞比例相对较少，可以对抗原特异性的B细胞进行富集。▶将抗原包被在培养板或其他基质上，然后与脾细胞结合，那些表面具有特异性抗体的B细胞与抗原结合使得B细胞黏附于培养板或基质上，轻轻洗涤除去不黏附的细胞，留下的细胞为具有特异性抗体的B细胞，用于细胞融合。现在是45页\一共有101页\编辑于星期四

3.

骨髓癌细胞的准备：▶融合亲本的骨髓瘤细胞，最好是同种的骨髓瘤细胞或浆细胞瘤系。这些细胞具有发达的内质网，能产生大量所需抗体，但必须是不能产生自身基因编码的抗体，否则杂交细胞会产生两种以上的抗体，无法得到单克隆抗体。▶瘤细胞系必须是对选择剂敏感的，融合后可以用药物(选择剂)把未融合的瘤细胞除去。常用来自BALB/c小鼠的653、Sp/20、NS-1等。现在是46页\一共有101页\编辑于星期四4.细胞融合：▶

一般用PEG诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞间进行融合，操作在10min内完成；骨髓瘤细胞：脾细胞为1～2：10。▶将富集的对抗原具有特异性的B细胞或将抗原直接交联到骨髓瘤细胞表面，再与脾细胞共温育，使具有产生特异抗体的B细胞与交联抗原的骨髓瘤细胞发生特异性结合，然后再进行融合，提高融合的特异性。▶融合后的细胞以1~2106个细胞/ml的浓度接种到96或24孔板中培养。现在是47页\一共有101页\编辑于星期四促细胞融合的方法有：A.病毒融合剂诱发细胞融合:

其中仙台病毒(HVJ)是最早用于动物细胞融合的融合剂。B.化学融合剂诱发细胞融合：

其中以聚乙二醇(PEG)最为常用。C.电融合法：利用直流电脉冲诱导细胞间融合。现在是48页\一共有101页\编辑于星期四A.病毒融合剂诱发细胞融合▶最早被采用的包括疱疹病毒、麻疹病毒和致瘤病毒等有膜病毒，但使用最广的是灭活的仙台病毒；▶病毒被膜含有膜蛋白，其表面有许多具神经氨酸酶和凝血活性的刺起，它们降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集在病毒周围，在高pH和Ca2+的条件下，膜上蛋白质分子的重新分布，使膜中脂类分子重排，从而打开质膜，导致细胞融合。现在是49页\一共有101页\编辑于星期四用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图

现在是50页\一共有101页\编辑于星期四▶使用仙台病毒融合悬浮细胞时，将两种亲本细胞的悬液混合在一起离心，后将细胞沉淀悬于灭活的仙台病毒悬液中，使其进行融合，再洗去病毒，即可将融合的细胞加入选择培养液进行选择培养；▶融合贴壁细胞时，可将两亲本细胞混合培养，然后将病毒直接加入到混合培养物中，培养一定时间后加选择培养液进行选择；融合效率比悬浮细胞高。现在是51页\一共有101页\编辑于星期四B.化学融合剂诱发细胞融合▶主要包括聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇、聚甘油、溶血卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱等，其中以PEG最为常用。▶

PEG比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合的能力更强。▶

PEG(polyethyleneglycol,PEG)是一种线形的多聚化合物，有多种不同的分子量，常用于细胞融合的PEG分子量在1000~4000，浓度在30~50%间。现在是52页\一共有101页\编辑于星期四PEG诱导细胞融合的机理：

带有大量负电荷的PEG与水之间的氢键结合，使溶液中自由水消失，由于高度脱水引起细胞凝集，形成大小程度不同的凝集物。细胞发生皱缩并大大扭曲变形，邻近细胞之间紧密接触。现在是53页\一共有101页\编辑于星期四在相邻细胞膜紧密接触的部位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，形成很小的细胞质桥，之后细胞质桥逐渐扩大，两个细胞最终融合。现在是54页\一共有101页\编辑于星期四聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程现在是55页\一共有101页\编辑于星期四使用PEG时，通常通过离心使细胞紧密接触，然后在细胞沉淀中加入一定浓度的PEG，稍作用一段时间后(约30秒)后立即加液稀释以及时终止其作用。

使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。Ca2+的作用机理，有的认为是Ca2+和PO43-形成不溶于水的配合物，成为细胞间的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca2+结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分子在膜上相互分离，由此引起融合。现在是56页\一共有101页\编辑于星期四PEG诱导鸡红细胞融合现在是57页\一共有101页\编辑于星期四PEG法植物原生质体的融合图1烟草叶肉细胞和洋葱根尖细胞原生质体融合（40×）

图2烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体的异源融合烟草洋葱现在是58页\一共有101页\编辑于星期四C.电融合法电处理融合法是20世纪80年代发展起来的细胞融合技术，使融合率大为提高。电融合的原理：

当细胞处于强电场脉冲时，电脉冲诱发细胞膜结构紊乱，膜上会短暂地形成微膜孔，相邻两个细胞紧密排列部位的微孔就会有物质交流，形成细胞膜桥和细胞质桥，进而引起细胞融合产生杂交细胞。现在是59页\一共有101页\编辑于星期四电融合诱导法原理示意图现在是60页\一共有101页\编辑于星期四实际操作：

先把待融合的细胞或原生质体混合，取样置于100V/cm的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形成串珠状排列；

完整烟草原生质体原生质体成串现在是61页\一共有101页\编辑于星期四

再用1~5KV/cm直流电脉冲，微秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细胞膜造成若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的形成。现在是62页\一共有101页\编辑于星期四电融合法原生质体的融合结果现在是63页\一共有101页\编辑于星期四细胞核移植中的细胞融合融合中融合后融合前现在是64页\一共有101页\编辑于星期四电融合技术的扩展：▶离心电融合：利用离心使相邻细胞紧密接触以提高融合率。▶特异性电融合：利用生物素－抗生物素－抗原－抗体桥联，使带有生物素标记的骨髓瘤细胞与具有特异抗体的B细胞间特异性配对；或直接将抗原标记到骨髓瘤细胞表面，利用抗原抗体特异性结合使两种细胞特异性配对，然后用高压电脉冲诱导细胞融合。现在是65页\一共有101页\编辑于星期四▶细胞化学聚集电融合：采用低浓度PEG、PHA或伴刀豆蛋白A等使细胞聚集接触，然后用电脉冲诱导细胞融合。▶磁－电融合：利用磁场使已表面磁化的细胞相互聚集接触，然后在用电脉冲诱导融合。现在是66页\一共有101页\编辑于星期四电融合的优点：适应的细胞类型广；不需加外源因子，如PEG等；对细胞毒性相对低；融合率高，可达50%~80%；可用于细胞数量很少的融合；可定向诱导细胞融合;有利于融合细胞的挑选。现在是67页\一共有101页\编辑于星期四电融合的不利之处：融合仪价格昂贵；两细胞大小差异较大时，电压较难选择；融合膜成分不同时细胞较难融合现在是68页\一共有101页\编辑于星期四5.融合细胞的筛选与克隆▶在细胞融合过程中，不仅两类不同细胞间发生融合，两类亲本细胞也能发生相互融合现象。含两个不同亲本细胞核的细胞称异核体

或异核细胞。由同一亲本细胞融合形成的细胞称同核体或同核细胞。▶利用PEG和仙台病毒进行融合时，细胞融合有一定的随机性，除形成杂交细胞外还会出现各亲本细胞自身融合，需对杂交细胞及时分离或筛选出来。现在是69页\一共有101页\编辑于星期四▶大部分多核细胞在一周内死亡，只有少数异核细胞、尤其双核异核细胞会存活。并通过有丝分裂使两个不同亲本细胞的染色体合并在一个细胞核中，形成杂交细胞。▶利用酶缺陷型、营养缺陷型、温度敏感性、形态和行为等标志，建立了多种选择选择系统，最常用的是酶缺陷型HAT选择培养法。现在是70页\一共有101页\编辑于星期四▶A.初步筛选：融合后马上以HAT培养，能活下来的大多为B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。未融合的骨髓瘤及骨髓瘤细胞间相互融合的细胞在HAT中因DNA合成抑制而死亡。未融合的B细胞及B细胞相互融合的细胞在体外培养因无法增殖会渐渐死去。现在是71页\一共有101页\编辑于星期四▶核酸的正常代谢途径若被氨基蝶呤(A)阻碍，可由补救途径利用次黄嘌呤(H)通过次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)催化产生肌苷酸(IMP)，并利用胸腺嘧啶核苷(T)通过胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化产生脱氧核苷酸来合成DNA。但骨髓瘤细胞缺乏TK及HGPRT两种酶，因此在A存在下无法生长；正常细胞(如B细胞)则可经由补救途径继续生长。现在是72页\一共有101页\编辑于星期四▶骨髓瘤细胞与正常的B细胞形成的杂交瘤，因正常细胞可以提供TK及HGPRT两酶，故在HAT培养基中可以正常生长。现在是73页\一共有101页\编辑于星期四现在是74页\一共有101页\编辑于星期四▶B.抗体专一性筛选：并非所有B细胞都产生实验所要的抗体，小鼠原先就存在许多B细胞株对抗一般疾病；因此要对杂交瘤细胞产生的抗体专一性进行筛选，这也是单克隆抗体制备中最关键的步骤之一。用于筛选杂交瘤细胞的方法大致有第二抗体法、抗原结合法和功能筛选法三类；常用的方法是第二抗体法，包括固相放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫法(ELISA)和荧光活化细胞分类器法(FACS)等，通过这些方法挑出产生专一性抗体的集落。现在是75页\一共有101页\编辑于星期四▶C.细胞克隆化：通过抗体专一性挑出来的细胞株，也许仍含有两群以上的细胞，因此要进行单克隆化；一般采用有限稀释法或软琼脂法对杂交瘤细胞进行细胞克隆化，获得来自单个细胞的克隆；并对单个细胞生长出的群落，再次以ELISA筛选专一性抗体，获得可产生特异性抗体的单克隆细胞株。现在是76页\一共有101页\编辑于星期四▶得到稳定的抗体后，通常要再以ELISA方法检定该抗体的亚型是属于IgG,IgM或IgA等。免疫时间太短的，较可能取得IgM，但一般仍以IgG较多。现在是77页\一共有101页\编辑于星期四6.单克隆抗体的大量制备：

单克隆抗体的大量制备可分为体内法和体外法。体内法：可把筛选出来的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，诱导小鼠产生大量腹水，然后以针头收集所产生的腹水，通常每次可取得3～5mL左右；腹水中的抗体浓度高，可达到1～25g/mL。其缺点是不适合大规模生产，腹水中有可能混有小鼠本身的抗体，给纯化抗体带来困难。体外法：把融合细胞在大型培养瓶中用无血清培养基进行培养，收集培养液上清即得抗体。缺点是抗体浓度低，仅为0.5～1gmL。现在是78页\一共有101页\编辑于星期四三、人源性单克隆抗体

和基因工程抗体现在是79页\一共有101页\编辑于星期四1.EB病毒转化技术：利用类似于疱疹病毒的EB病毒在体外直接感染人外周血淋巴细胞（来源于淋巴结、扁桃体、脐带血、外周血等），使之转化获得永生能力得到人B淋巴细胞系，这些细胞可在体外分泌人抗体。(一)、人源性单克隆抗体现在是80页\一共有101页\编辑于星期四技术同鼠－鼠杂交瘤，亲本骨髓瘤细胞主要有来自小鼠的骨髓瘤653、SP2/0、NS-1，来自大鼠的骨髓瘤Y3Ag1.2.3等；亲本B细胞来源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。但人－鼠杂交瘤的单克隆抗体分泌性能不稳定，多数情况下由于人染色体的丢失导致杂交瘤细胞失去分泌抗体的能力。

2.人－鼠杂交瘤单克隆抗体：技术同鼠－鼠杂交瘤，亲本骨髓瘤细胞主要有来自小鼠的骨髓瘤653、SP2/0、NS-1，来自大鼠的骨髓瘤Y3Ag1.2.3等；亲本B细胞来源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。但人－鼠杂交瘤的单克隆抗体分泌性能不稳定，多数情况下由于人染色体的丢失导致杂交瘤细胞失去分泌抗体的能力。现在是81页\一共有101页\编辑于星期四3.人－人杂交瘤单克隆抗体：人－人杂交瘤操作步骤基本上与小鼠－小鼠杂交瘤技术相同，使用人的骨髓瘤细胞与人的B淋巴细胞融合；但可供利用的人骨髓瘤细胞种类非常有限，人的骨髓瘤细胞在融合率、非分泌型方面仍不及小鼠骨髓瘤细胞；而且人不能像小鼠那样进行高度免疫，B淋巴细胞常限于取自外周血(小鼠取自动物脾脏)，激活状态不适合做融合；故人－人杂交瘤细胞在融合、融合后的筛选以及融合细胞分泌抗体方面仍不理想。现在是82页\一共有101页\编辑于星期四4.构建转入Ig基因组小鼠▶将改造过的人的抗体基因组导入小鼠胚胎，得到在免疫后能产生人抗体的转基因小鼠。改造过的抗体除了构成抗原识别与抗原结合部位的三个互补决定区(CDR)是鼠源的以外，其余部分均是人源的。▶用人Ig基因组取代小鼠Ig基因组获得转基因小鼠，以后仅需免疫小鼠制作单克隆抗体，但获得的是人抗体而非小鼠抗体。该技术难度较大，但已有成功的报道。现在是83页\一共有101页\编辑于星期四5.严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体：SCID小鼠具有严重免疫缺陷，对外源组织无免疫排斥反应，故这种小鼠可接受人体组织或器官移植，形成人－鼠嵌合体小鼠。将人免疫干细胞移植到SCID小鼠体内，SCID小鼠获得了人的免疫系统。这种小鼠可用任何抗原免疫，从激活的淋巴细胞中富集抗原特异性人源性B淋巴细胞，进一步进行细胞融合或制备抗体库。现在是84页\一共有101页\编辑于星期四(二)、基因工程抗体

基因工程抗体是利用基因工程的手段获得人源性抗体，主要包括以下几个方面：人－鼠嵌合抗体、改型抗体、抗体片段、噬菌体抗体文库技术、表位印迹选择技术等。现在是85页\一共有101页\编辑于星期四抗体的重轻链构成的可变区(V区)与识别抗原有关，具有特异性；而恒定区(C区)与效应功能有关。人－鼠嵌合抗体就是通过人工改造使抗体的V区是鼠源的，而C区是人源的。如此改造的嵌合抗体保留了原来鼠源单克隆抗体的特异性和亲和力，人抗小鼠抗体反应(HAMA)也明显减弱。1.人－鼠嵌合抗体：现在是86页\一共有101页\编辑于星期四人－鼠嵌合抗体的制备

现在是87页\一共有101页\编辑于星期四2.改型抗体：

也称CDR移植。用鼠源的CDR(可变区中和抗原互补结合构成抗原结合部位的部分）取代人抗体中相应的CDR部位，使得抗体中除构成抗原结合部位的3个CDR是鼠源以外，其余均为人源。这种抗体在人体内免疫性大大降低。现在是88页\一共有101页\编辑于星期四改型抗体（CDR移植）现在是89页\一共有101页\编辑于星期四

Fab抗体：抗体Y形的两个臂称为Fab，它由可变区和小部分的恒定区组成，利用基因工程的方法构建具有可变区和小部分恒定区的Fab抗体，这样的抗体仍具有特异结合抗原的特性。

单链抗体(ScFv)：用短肽接头[常用(Gly4Ser)3]将重链可变区和轻链可变区相连，使其分子变小，更有利于穿透组织和清除，而且易构建表达；但亲和力会出现一定的下降。3.抗体片段：现在是90页\一共有101页\编辑于星期四4.噬菌体抗体文库技术体外建立一个相应于体内B细胞库的抗体库，从中筛选所需要的抗体。利用PCR扩增重链和轻链的cDNA，并插入到噬菌体外壳蛋白的编码基因中，然后感染E.coli，使抗体基因的表达产物和外壳蛋白一起融合展示在噬菌体表面，成为噬菌体抗体。通过固相化的抗原进行筛选，不能结合抗原的噬菌体被洗去，结合的噬菌体被洗脱下来再次感染细菌进行扩增，多次吸附－洗脱－扩增后可获得所要的抗原特异性的噬菌体抗体。这些抗体可以做到全部为人源的。现在是91页\一共有101页\编辑于星期四现在是92页\一共有101页\编辑于星期四5.表位印模选择技术：用特定的已知抗原从抗体组合文库中或噬菌体抗体文库中筛选所需抗体，通过抗体可变区与抗原结合及编码轻、重链可变区鼠源性与人源性基因置换、匹配，从而获得能与抗原特异性反应的人源性抗体；将筛选到的含人轻、重链基因的质粒转染到骨髓瘤SP2/0细胞中，该细胞即可产生人单克隆抗体。现在是93页\一共有101页\编辑于星期四四、单克隆抗体的应用

1.理论研究：▶构建B淋巴细胞杂交瘤可用于分析B细胞的多样性及其产生机理，并能分析免疫应答中抗体的多样性。▶利用单克隆抗体可进行表位分析：利用单克隆抗